菌种室的操作与管理

《菌种室操作与管理》教学内容一、谷氨酸发酵工业对菌种的要求二、现用谷氨酸生产菌的特征三、谷氨酸生产菌选育方法四、谷氨酸高产菌株诱变实例五、菌种保藏技术六、菌种室日常管理与工作要求一、谷氨酸发酵工业对菌种的要求①菌种在有限的发酵过程中生长繁殖快和代谢能力强。周期短产率高②菌种遗传特性稳定，不易变异退化，且菌种所要求的工艺控制比较粗放，易于控制，有利于发酵生产运行和产品质量的稳定。遗传稳定工艺粗放自发突变回复突变变异多个遗传标记的菌株基因工程菌株③发酵过程中产生的副产物少，不但有利于提高底物的有效转化率，而且目的产物分离容易，有利于降低提取成本和提高产品质量。副产物少④抗噬菌体感染的能力强。例如曾经选育出很多抗噬菌体的菌株⑤菌种不是病源菌，对人、动物、植物和环境都不具有潜在的危害性。安全性⑥菌种具备利用广泛来源原料的能力，并对发酵原料成分波动的敏感性尽可能小。原料粗放二、现用谷氨酸生产菌的主要特征◆

①需氧型微生物。◆②生物素缺陷型。◆

③革兰氏染色阳性。◆

④

α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱。◆⑤CO2固定反应酶系活力强。◆⑥异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱。◆⑦不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸。谷氨酸生物合成途径三、谷氨酸生产菌选育方法与思路自然选育诱变选育杂交育种原生质体融合技术基因工程育种1、自然选育不经过人工处理，而是根据微生物的自然突变进行筛选菌种的过程，称为自然选育。自然突变筛选宇宙射线、各种短波辐射、环境中的诱变物质、微生物产生的诱变物质自然选育一般流程采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。（1）采样（2）增值培养所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。（3）纯种分离划线法分区划线适用于浓度较大的样品；连续划线适用于浓度较小的样品。稀释涂布法（4）初筛定性或半定量测定如何初筛产谷氨酸菌株？筛选产谷氨酸的菌株细菌营养琼脂培养基进行培养，培养后喷上茚三酮溶液，产生谷氨酸的菌落周围就显红色，红色圈愈大表示产酸能力愈强。（5）复筛将初筛选出的菌株精确地测出其性能摇瓶培养法小型发酵罐培养法2、诱变选育利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变选育。诱变选育的典型流程出发菌株菌悬液诱变分离初筛复筛稳定性试验特性考察（1）诱变选育的主要环节①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高。②用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。（2）影响诱变育种的主要因素①出发菌株的选择②单细胞悬液的制备③前培养④诱变因素及其剂量的选择①出发菌株的选择野生菌株生产中自发突变的高产菌株经诱变获得的高产菌株一般认为诱变获得高产菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难。采用连续诱变的方法，在每次诱变之后选出3~5株较好的菌株继续诱变。如果遇到高产菌株再诱变进一步提高产量效果不佳时，可以先行杂交。再作为诱变的出发菌株，这样有可能收到比较好的效果。②单细胞悬液的制备☀

达到单细胞状态，均匀接触诱变剂。☀

一般处理细菌的营养细胞，采用生长旺盛的对数期，其变异率较高且重现性好。☀细菌和放线菌的孢子的浓度大约为108个／mL。③前培养诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20~60min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。④诱变因素及其剂量的选择凡是能引起生物体遗传物质发生突然或根本改变的物质。物理诱变剂：紫外线、X射线、r射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光、宇宙线等。化学诱变剂：碱基类似物、烷化剂（亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等）、吖啶色素等。诱变剂的剂量绝对剂量相对剂量紫外线：erg-1/mm2erg（尔格）：功的单位电离辐射：拉德（rad）伦琴（R）照射时间凡是在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。四、谷氨酸生产菌诱变育种实例出发菌株前培养菌悬液制备60Co诱变平板分离斜面摇瓶初筛60Co诱变株前培养菌悬液制备NTG诱变平板分离斜面摇瓶初筛复筛稳定性试验选出菌株出发菌株前培养菌悬液制备天津短杆菌T6-13液体培养基、摇瓶培养6~8h无菌水稀释108个/mL选定500Gy作为60Co诱变剂量60Co诱变60Co照射致死曲线单位物质吸收的能量称为吸收剂量。其计量单位为戈瑞（Gy）：即是每千克物质中吸收1焦耳的能量（J/kg）平板分离稀释涂布平板培养挑取100株以上斜面培养如何挑取菌落？平板使用定性培养基添加显色剂添加碳酸钙添加维生素P类衍生物抗性株：细胞膜通透性好添加谷氨酸结构类似物抗性株：解除反馈抑制斜面发酵培养基摇瓶发酵检测谷氨酸浓度选出5~10株备份60Co诱变结果60Co诱变株NTG诱变NTG0.02%选定30min平板分离摇瓶筛选NTG诱变结果稳定性试验传代10次五、菌种保藏技术（1）菌种保藏原理菌种保藏是保证生产菌种质量的重要环节，其目的在于不污染杂菌，使退化和死亡降低到最低限度，尽可能使菌种保持原来的优良性能。菌种保藏的基本原理是根据菌种的生理，生化特性，人为地创造条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等）并创造有利用于休眠状态的环境条件。降低培养基营养成分低温干燥缺氧（2）常见的保藏方法

定期移殖法

包括斜面菌种保藏、半固体穿刺菌种保藏及用石蜡油封藏等方法，不需要特殊设备和技术，为一般实验室和工厂普遍采用。

定期移殖法

通常将菌种在新鲜琼脂斜面培养基上或穿刺培养，然后将试管口防水密封，放入4℃冰箱中保存，使微生物在低温下维持很低的新陈代谢，缓慢生长，当培养基中的营养物逐渐被耗尽后再重新移植于新鲜培养基上，如此定期移植，又称为定期移植保藏法或传代培养保藏法。定期移植的间隔时间因微生物种类不同而异，不产芽孢的细菌间隔时间较短，一般为2周至1个月。

甘油保藏法

将80%甘油置于三角瓶中，塞上棉塞，外加牛皮纸包扎，于121℃下蒸汽灭菌20min，冷却后备用。取培养适龄的斜面菌种，用无菌的生理盐水洗下菌苔细胞，制成108个/mL的菌悬液，然后，加入等量的甘油混匀，制成含40%左右甘油的菌悬液，置于-20℃的冰箱中保存。一般可保藏3~5年。

此法的基本操作流程是：将微生物制成悬浮液，加入保护剂，然后装入特制的安瓿管内，并迅速冷冻至-30℃左右，在低温下迅速用真空泵抽干，最后将安瓿管在抽真空情况下熔封，置于低温保藏。真空冷冻干燥保藏法保护剂的作用是使悬浮液保持活性，尽量减少冷冻干燥时对微生物造成的损伤。真空冷冻干燥保藏法是目前比较理想的保藏方法，保藏期可长达5~10年，具有变异小和适用范围广的特点，为各保藏机构广泛采用。液氮超低温保藏法其方法是：

①将浓的菌悬液加入无菌的防冻保护剂（细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%的二甲亚砜），每个安瓿管分装2~10mm高度的菌悬液，立即熔封。②封口后对安瓿管进行严格检查，确保不致使液氮渗入安瓿管。③以每分钟降低1℃的速度冷却至-25℃左右，然后放入液氮罐，有的菌种在放入液氮罐之前，须用干冰-乙醇等制冷剂冷却至-78℃再放入液氮罐中。安瓿管保藏在-196℃的液氮罐中，保藏期可长达10年之久。液氮每周的蒸发量大约为1/10，保藏期间要注意液氮的补充，使液氮面保持在固定水平。从液氮罐中取出安瓿管，应放入38~40℃的温水中振荡1~2min，使之完全融化，有利于细胞的复苏，ATCC的经验认为这样处理后再移种的安瓿管比自然融化的存活率高。六、菌种室日常管理与工作要求（1）每天要对无菌室进行沉降菌检测。（平板法）定期进行清洁、灭菌等工作。洁净级别100000菌落数＜1010000＜31000＜2100＜1

9cm平板露置30min，37℃培养24h。

（2）培养基配制尽量做到精准，灭菌操作要规范。①配制培养基时，要复核。②每次灭菌时要检查灭菌锅的压力、温度是否正常，定期校准仪表。③斜面灭菌后需经空白培养，无菌检查合格后方可使用。④需选用糖蜜、玉米浆和尿素，并调节好用量。（3）严格控制培养条件，定期检查培养设施。①温度：32℃②pH：斜面——7.0，摇瓶