生物工艺原理第二学期期末考试题库及答案

生物工艺原理第二学期期末考试题库及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.关于酶固定化方法的描述，错误的是（）。A.吸附法操作简单，但酶与载体结合力较弱B.包埋法适用于小分子底物和产物的反应系统C.共价结合法酶与载体结合牢固，但可能影响酶活性中心D.交联法使用的交联剂（如戊二醛）通常对酶活性无影响2.在分批发酵过程中，当微生物处于稳定期时，下列描述正确的是（）。A.菌体浓度达到最大，且以最大比生长速率生长B.次级代谢产物开始大量合成C.营养物质耗尽，细胞死亡速率大于生长速率D.溶解氧浓度会因菌体停止生长而显著上升3.动物细胞大规模培养中，用以防止细胞凋亡最常用的措施是（）。A.添加高浓度血清B.添加特定生长因子（如IGF-1）C.使用抗凋亡基因（如bcl-2）工程细胞系D.降低培养温度4.下列哪种分离方法主要依据物质分子大小的差异？（）A.离子交换层析B.疏水相互作用层析C.凝胶过滤层析D.亲和层析5.关于双水相萃取技术，以下说法正确的是（）。A.常用的双水相系统是由两种互不相溶的有机溶剂组成B.目标产物在上下两相中的分配系数仅与产物性质有关C.聚乙二醇（PEG）/硫酸盐系统是常用的双水相系统之一D.该技术不适用于蛋白质等生物大分子的分离6.在膜过滤过程中，引起膜污染的主要因素不包括（）。A.浓差极化B.料液中颗粒物的堵塞C.膜表面与溶质之间的化学作用D.操作压力远低于临界通量7.基因工程菌发酵过程中，为维持质粒稳定性，不宜采用的策略是（）。A.在培养基中添加选择性压力（如抗生素）B.使用营养缺陷型宿主菌C.尽可能提高菌体的比生长速率D.构建含par位点的质粒8.下列哪种生物反应器最适合对剪切力敏感的动植物细胞培养？（）A.机械搅拌式反应器B.鼓泡塔反应器C.气升式环流反应器D.流化床反应器9.蛋白质复性过程中，为减少聚集体的形成，常采用的方法是（）。A.快速稀释至高浓度变性剂中B.在复性缓冲液中添加低浓度变性剂（如尿素）C.提高蛋白质浓度以促进正确折叠D.在复性时剧烈搅拌以增加混合效率10.下游纯化工艺中，用于去除内毒素的最有效方法是（）。A.阴离子交换层析B.阳离子交换层析C.疏水相互作用层析D.亲和层析（如组氨酸标签纯化）二、多项选择题（每题3分，共15分。每题至少有两个正确选项，多选、少选、错选均不得分）1.影响微生物发酵液中溶解氧浓度（DO）的主要因素有（）。A.搅拌转速B.通气量C.罐压D.发酵液黏度E.菌体浓度2.关于植物细胞悬浮培养的特点，下列描述正确的有（）。A.细胞生长速度通常比微生物快B.细胞易聚集成团，影响传质C.对剪切力敏感D.目标产物多为胞内产物，需破碎细胞提取E.培养过程中需添加植物生长调节剂3.下列属于初级代谢产物的有（）。A.青霉素B.乙醇C.柠檬酸D.维生素B12E.氨基酸4.可用于蛋白质纯度检测的分析方法有（）。A.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）B.高效液相色谱（HPLC）C.紫外光谱扫描（A260/A280比值）D.等电聚焦电泳（IEF）E.质谱分析（MS）5.在发酵过程优化中，响应面分析法（RSM）相对于单因素实验法的优势体现在（）。A.实验次数少，效率高B.可以研究因素间的交互作用C.能够建立因素与响应值之间的数学模型D.实验设计简单，无需考虑因素范围E.可直接确定最优工艺条件三、填空题（每空1分，共15分）1.微生物的典型生长曲线可分为延滞期、______、稳定期和______。2.在恒化器连续培养中，通过控制______来调节微生物的比生长速率。3.酶催化反应的米氏方程表达式为v=，其中称为______，其值等于反应速率达到最大反应速率一半时的______浓度。4.用于大规模动物细胞培养的无血清培养基通常需要添加______、______和微量元素等关键成分。5.蛋白质盐析常用的中性盐是______和______。6.离子交换层析中，若目标蛋白质在pH7.0时带负电，应选用______类型的离子交换剂进行吸附。7.超滤膜截留分子量的定义是能被膜截留______%的最小溶质分子量。8.在结晶操作中，为了获得较大且均匀的晶体，应控制______速率。9.基因工程产品生产过程中，发酵结束后需进行细胞破碎，常用的机械破碎方法有高压匀浆法和______。10.固定化酶的表观米氏常数通常比游离酶的______，这是由于______效应造成的。四、简答题（每题6分，共30分）1.简述微生物次级代谢产物的生物合成特点。2.简述机械搅拌式生物反应器中搅拌器的主要作用。3.简述双水相萃取技术用于分离蛋白质的优点。4.简述疏水相互作用层析（HIC）的基本原理及其洗脱方式。5.在重组蛋白表达中，包涵体形成的原因是什么？简述包涵体蛋白复性的主要步骤。五、计算题（每题8分，共16分）1.在某一分批发酵过程中，已知微生物的最大比生长速率=0.5，饱和常数=0.2g/L。若初始底物浓度=2.使用SephadexG-75凝胶层析柱（排阻极限为80kDa）分离含有细胞色素c（12.4kDa）、牛血清白蛋白（BSA，66.5kDa）和免疫球蛋白G（IgG，150kDa）的混合蛋白质溶液。请预测这三种蛋白质的洗脱顺序，并说明理由。六、分析应用题（第1题12分，第2题12分，共24分）1.某公司利用大肠杆菌发酵生产一种重组药用蛋白。发酵过程中发现，在对数生长中后期，溶氧（DO）值迅速下降至接近零，即使提高搅拌转速和通气量，DO回升效果也不明显，随后菌体浓度停止上升，产物表达量远低于预期。请分析可能导致此现象的原因（至少三点），并提出相应的解决策略。2.设计一个从酵母发酵液中分离纯化一种分子量为45kDa、等电点（pI）为5.8的胞内酶X的初步工艺路线。要求该酶在pH5.0-8.0范围内稳定，且其活性依赖于二价金属离子Mg²⁺。请写出主要步骤（从发酵液开始到获得初步纯化的酶液），并简要说明每一步骤的目的和依据。生物工艺原理期末考试题库答案一、单项选择题1.D。交联法使用的交联剂（如戊二醛）通常对酶活性有影响，因其可能与酶活性中心的氨基酸残基反应。2.B。稳定期菌体生长速率与死亡速率相等，菌体浓度基本不变，此时往往是次级代谢产物大量合成的时期。3.C。使用导入抗凋亡基因（如bcl-2）的工程细胞系是从根本上增强细胞抗凋亡能力的有效方法。4.C。凝胶过滤层析（又称尺寸排阻层析）是根据分子大小和形状进行分离的。5.C。聚乙二醇（PEG）/硫酸盐系统以及PEG/葡聚糖系统是常用的双水相体系。6.D。操作压力低于临界通量有助于减轻膜污染，不是引起污染的因素。A、B、C均是导致膜污染的主要原因。7.C。过高的比生长速率会增加质粒不稳定性，不利于质粒的维持。8.C。气升式反应器依靠气体鼓泡驱动液体循环，无机械搅拌，剪切力小，适合对剪切敏感的细胞培养。9.B。在复性缓冲液中添加低浓度变性剂（如0.5-1M尿素或盐酸胍）可以抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，减少聚集。10.A。内毒素（脂多糖）在pH>2时带强负电，因此阴离子交换层析在合适条件下可有效吸附内毒素，从而达到去除目的。二、多项选择题1.A,B,C,D,E。所有选项均影响氧传递速率（OTR）或氧消耗速率（OUR），从而影响DO。2.B,C,D,E。植物细胞生长速度比微生物慢得多（A错）。其他选项均为植物细胞悬浮培养的典型特征。3.B,C,E。乙醇、柠檬酸、氨基酸是微生物生长所必需的基本代谢产物。青霉素和维生素B12属于次级代谢产物。4.A,B,D,E。SDS、HPLC、IEF和MS都是判断蛋白质纯度的有效方法。A260/A280比值主要用于评估核酸污染，不能精确判断蛋白质纯度。5.A,B,C,E。RSM是优化工艺条件的有效方法，可以建立模型、研究交互作用、减少实验次数并寻优。实验设计时需预先确定合理的因素与水平范围（D错）。三、填空题1.对数期（指数期），衰亡期2.稀释率3.米氏常数，底物4.胰岛素（或类似物），转铁蛋白（或其他必需的激素和生长因子，顺序可调）5.硫酸铵，硫酸钠（或氯化钠，但硫酸铵最常用）6.阴离子（或强阴离子，如DEAE）7.908.晶核形成（或冷却/蒸发）9.珠磨法（或球磨法）10.大（或高），扩散（或空间位阻）四、简答题1.微生物次级代谢产物的生物合成特点：①一般在对数生长后期或稳定期合成，与菌体生长不偶联；②产物结构复杂，种类繁多，多为种属特异性；③合成途径复杂，多由多酶体系催化，受多基因调控；④其合成对环境因素（如营养、pH、温度）敏感，易受调控；⑤生理功能不明确，通常不是微生物生长所必需。2.机械搅拌式生物反应器中搅拌器的主要作用：①打碎气泡，增加气液接触面积，提高溶氧速率（OTR）；②使反应器内物料混合均匀，保证温度、pH、营养物质浓度均一；③强化传质过程，包括气液、液固、液液相传质；④使菌体或细胞在培养液中均匀悬浮。3.双水相萃取技术用于分离蛋白质的优点：①两相均为水相，界面张力极低，为生物大分子提供温和的分离环境，有利于保持其生物活性；②操作简便，易于放大，适合连续操作；③分相时间短，处理量大；④选择性较高，可通过改变相系统组成、pH、离子强度等调节分配系数；⑤能与后续纯化步骤较好衔接。4.疏水相互作用层析（HIC）基本原理：在高盐浓度下，蛋白质表面疏水区域暴露，与固定相上的疏水配基（如苯基、丁基）通过疏水作用结合。洗脱方式：通常采用降低流动相盐浓度的梯度洗脱法（负梯度）。随着盐浓度降低，蛋白质与固定相间的疏水作用减弱，不同蛋白质按疏水性强弱依次被洗脱。5.包涵体形成原因：重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时，合成速度过快，局部浓度过高，缺乏正确的折叠环境和辅助因子（如分子伴侣），导致部分折叠中间体发生错误折叠和疏水聚集，形成不溶性的蛋白质聚集体。主要复性步骤：①离心收集并洗涤包涵体，去除杂质；②用强变性剂（如8M尿素或6M盐酸胍）溶解包涵体，使蛋白质完全变性展开；③通过稀释、透析或层析方法缓慢去除变性剂，并提供合适的氧化还原环境（如有需要），使蛋白质重新折叠成天然活性构象。五、计算题1.解：根据Monod方程：μ将=0.5，=0.2gμ答：此时的比生长速率μ约为0.417。2.解：预测洗脱顺序为：免疫球蛋白G（IgG）→牛血清白蛋白（BSA）→细胞色素c。理由：凝胶过滤层析是根据分子大小进行分离，大分子因无法进入凝胶颗粒内部孔道，流经路径短，先被洗脱出来；小分子可进入大部分孔道，流经路径长，后被洗脱。SephadexG-75的排阻极限为80kDa。IgG分子量（150kDa）大于排阻极限，完全被排阻，最先洗脱；BSA分子量（66.5kDa）小于但接近排阻极限，部分进入孔道，第二个洗脱；细胞色素c分子量（12.4kDa）远小于排阻极限，可进入大部分孔道，最后洗脱。六、分析应用题1.原因分析与解决策略：可能原因一：菌体浓度过高，耗氧速率（OUR）超过反应器的最大供氧能力（OTR_max）。策略：优化培养基配方或采用流加/补料分批发酵，控制菌体不过度生长；或考虑更换传氧效率更高的反应器或搅拌桨型。可能原因二：发酵液黏度显著增加。这可能由于大肠杆菌形成荚膜或自身裂解释放核酸等大分子物质导致。策略：优化发酵条件减少细胞裂解；在发酵中后期可考虑添加低浓度的DNA酶（DNase）以降低黏度；或采用能适应高黏度培养液的搅拌系统。可能原因三：发生染菌或噬菌体污染，导致菌体异常代谢，耗氧异常。策略：严格执行无菌操作，对发酵罐及管路进行彻底灭菌；检测是否染菌，若染菌需废弃该批次并彻底消毒系统。可能原因四：溶解氧电极故障或校准失效，显示值不准确。策略：定期对DO电极进行校准和维护，发酵前确认其正常工作。由于DO长期处于零，菌体处于严重缺氧状态，代谢途径改变，能量供应不足，导致生长停滞和产物合成受阻，因此产物表达量低。2.初步纯化工艺路线设计：（1）发酵液预处理与细胞收获：发酵结束后，通过离心或膜过滤分离酵母细胞，弃去上清发酵液。目的：收集含目标酶的菌体。（2）细胞破碎：采用高压匀浆法或珠磨法破碎酵母细胞。目的：释放胞内酶X。依据：酵母细胞壁较坚固，需要较强的机械破碎方法。（3）固液分离：将破碎后的浆液离心，取上清液（粗酶液）。目的：去除细胞碎片等不溶物。（4）硫酸铵盐析：向上清液中缓慢加入固体硫酸铵至一定饱和度（需通过预实验确定，例如40-60%），冰浴沉淀，离心收集沉淀。目的：初步浓缩和富集酶X，去除大量杂蛋白。依据：蛋白质在不同盐浓度下溶解度不同。（5）脱盐与缓冲液置换：将盐析沉淀用适量缓冲液溶解，通过透析或凝胶过滤层析（如SephadexG-25）脱盐，并置换至适合下一步层析的缓冲液中（如低盐浓度的缓冲液）。目的：去除高浓度盐分，为离子交换层析做准备。（6）阴离子交换层析