团体标准：南美白对虾5种病原快速检测 重组酶聚合酶扩增微流控芯片法

团体标准：南美白对虾5种病原快速检测重组酶聚合酶扩增微流控芯片法团体标准T/CAPPXXX—2026GroupStandard:RapidDetectionof5PathogensinPenaeusvannamei-RecombinasePolymeraseAmplificationMicrofluidicChipMethod2026-XX-XX发布2026-XX-XX实施中国水产学会、全国水产技术推广总站、中国水产科学研究院黄海水产研究所联合发布前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、XX省水产技术推广总站提出。本文件由中国水产学会归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、XX农业大学海洋学院、XX省水产疫病预防控制中心、XX生物科技有限公司、XX水产养殖专业合作社、XX出入境检验检疫技术中心。本文件主要起草人：XXX、XXX、XXX、XXX、XXX、XXX、XXX、XXX、XXX、XXX。引言南美白对虾（Penaeusvannamei）是我国水产养殖的主导品种之一，养殖规模大、产业链完善，在保障水产品供给、促进渔民增收等方面发挥着重要作用。然而，南美白对虾养殖过程中易受多种病原侵袭，其中白斑综合征病毒（WSSV）、桃拉综合征病毒（TSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是危害最严重的5种病原，可引发急性、高致病性疫病，传播速度快、死亡率高，给南美白对虾养殖产业造成巨大经济损失。当前，南美白对虾病原检测方法存在操作复杂、检测周期长、需专业设备、难以同时检测多种病原等问题，无法满足养殖现场快速筛查、疫病早期预警及流通环节检疫的需求。重组酶聚合酶扩增（RPA）技术具有快速、恒温、灵敏度高的优势，微流控芯片技术可实现多指标并行检测、样品消耗量少的目标，二者结合形成的RPA微流控芯片法，能够在短时间内完成5种病原的同步检测，兼顾准确性与便捷性。为规范南美白对虾5种病原的快速检测流程，统一RPA微流控芯片法的技术要求、操作步骤及结果判定标准，为养殖现场筛查、疫病监测、检疫检验、流行病学调查提供科学可靠的技术依据，依据《中华人民共和国动物防疫法》《水产养殖质量安全管理规定》《水生动物疫病诊断技术规范通则》等法律法规及相关标准，结合多年检测实践经验，制定本文件。本文件适用于南美白对虾养殖、流通、检疫等环节的5种病原快速检测，旨在推动检测技术标准化、高效化，助力南美白对虾养殖产业健康可持续发展。1范围本文件规定了南美白对虾中白斑综合征病毒（WSSV）、桃拉综合征病毒（TSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）、副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）5种病原的重组酶聚合酶扩增微流控芯片检测方法的术语和定义、原理、试剂与仪器、样品采集与处理、检测步骤、结果判定、质量控制、生物安全要求及检测记录。本文件适用于南美白对虾的卵、幼体、成体及养殖环境（水体、底泥）中上述5种病原的快速筛查与检测，也可用于出入境检疫、疫病监测及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1—2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T34722水生动物疫病诊断技术规范通则NY/T5361无公害食品中华鳖养殖技术规范SN/T1193进出口动物源性食品中病毒检测抽样和制样方法SN/T2724水生动物病毒核酸提取方法SN/T2399进出口水产品中副溶血弧菌检测方法《中华人民共和国动物防疫法》（2021年修订）《水产养殖质量安全管理规定》（2003年发布）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1重组酶聚合酶扩增（RecombinasePolymeraseAmplification,RPA）一种恒温核酸扩增技术，在37℃~42℃条件下，通过重组酶、聚合酶、单链结合蛋白的协同作用，快速扩增靶核酸序列，15min~20min内可完成扩增反应，具有高灵敏度、高特异性的特点。3.2微流控芯片（MicrofluidicChip）集成微通道、反应池、检测区等结构的微型芯片，可实现样品预处理、核酸扩增、产物检测等步骤的集成化、自动化操作，能够同时完成多种病原的并行检测。3.3靶病原本文件所指的5种病原，包括4种病毒：白斑综合征病毒（WSSV）、桃拉综合征病毒（TSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）；1种细菌：副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）。3.4阳性对照含有5种靶病原特异性核酸序列的标准品，用于验证检测方法的有效性和准确性，确保扩增反应正常进行。3.5阴性对照不含任何靶病原核酸序列的样品（如无酶水、健康南美白对虾核酸提取物），用于排除交叉污染及假阳性结果。3.6内参对照针对南美白对虾自身管家基因（如18SrRNA基因）设计的检测靶点，用于监控样品核酸提取质量及扩增反应体系的有效性，避免假阴性结果。4原理本方法以5种靶病原的特异性保守基因序列为检测靶点，设计特异性RPA引物和荧光探针。首先从南美白对虾样品或养殖环境样品中提取总核酸（病毒RNA/DNA、细菌DNA），将核酸提取物与RPA反应液、引物探针混合物加入微流控芯片反应池，在37℃~42℃恒温条件下进行RPA扩增反应。扩增过程中，荧光探针结合到靶序列上，随着扩增反应的进行，探针被降解释放荧光信号，微流控芯片检测仪实时采集各反应池的荧光信号，通过分析荧光曲线的出现时间（Ct值）和信号强度，判断样品中是否含有对应靶病原，实现5种病原的快速、同步检测。内参对照的荧光信号可验证核酸提取及扩增过程的有效性，阳性对照和阴性对照用于质量控制，确保检测结果可靠。5试剂与仪器5.1试剂5.1.1核酸提取试剂：包括裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液等，应符合SN/T2724规定，可选用商品化核酸提取试剂盒（适配动物组织、水体、底泥样品），确保核酸提取效率和纯度。5.1.2RPA反应试剂：包括重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、dNTPs、反应缓冲液等，应适配微流控芯片反应体系，在37℃~42℃条件下稳定发挥作用。5.1.3特异性引物与探针：针对5种靶病原的保守基因序列设计特异性引物和荧光探针（探针标记FAM、HEX、ROX等不同荧光基团，实现多通道区分），同时设计内参基因引物和探针。引物和探针需经特异性验证，无交叉反应，具体序列见附录A。5.1.4对照品：阳性对照为含5种靶病原特异性核酸序列的混合标准品（浓度10²~10³copies/μL）；阴性对照为无酶水或健康南美白对虾核酸提取物；内参对照为南美白对虾18SrRNA基因核酸标准品。5.1.5辅助试剂：无菌生理盐水、PBS缓冲液、无水乙醇、核酸酶抑制剂等，均为分析纯及以上级别。5.2仪器5.2.1微流控芯片系统：包括微流控芯片、芯片检测仪，具备恒温控制（精度±0.5℃）、多通道荧光信号采集（适配FAM、HEX、ROX等荧光基团）、实时数据分析及结果输出功能，芯片应预包被反应体系，支持5种病原+内参的同步检测。5.2.2核酸提取设备：包括高速冷冻离心机（转速≥12000r/min）、核酸提取仪（手动或自动）、恒温水浴锅（精度±1℃）。5.2.3样品处理设备：无菌研磨仪、匀浆机、移液器（量程0.5μL~1000μL，精度±2%）、无菌离心管、移液枪头。5.2.4辅助仪器：超净工作台、-20℃冰箱、-80℃冰箱、电子天平（精度0.1mg）、高压蒸汽灭菌锅。6样品采集与处理6.1样品采集6.1.1南美白对虾样品：a）卵和幼体：随机采集样品5g~10g，置于无菌离心管中，加入3倍体积PBS缓冲液，冰浴运输；b）成体：随机抽取健康或疑似患病对虾3~5尾，每尾体重≥50g，采集肝胰腺、鳃、肠组织各0.5g，混合研磨，制成匀浆；无症状对虾抽样检测时，每批次抽样量不少于30尾。6.1.2养殖环境样品：a）水体样品：采集养殖池表层、中层、底层水体各50mL，混合后取50mL置于无菌采样瓶中，加入无菌抗凝剂，冰浴运输；b）底泥样品：采集养殖池不同区域底泥各10g，混合后取10g置于无菌采样袋中，冰浴运输。6.1.3样品运输与保存：样品采集后应在4℃冰浴条件下24h内送达实验室，无法及时检测的样品，-20℃保存不超过7d，-80℃保存不超过1个月，避免反复冻融。6.2样品预处理6.2.1对虾组织样品：取0.1g匀浆样品，加入1mL无菌生理盐水，涡旋振荡10min，4℃、8000r/min离心10min，取上清液备用。6.2.2水体样品：取10mL水体样品，4℃、12000r/min离心15min，弃上清液，保留沉淀，加入1mL无菌生理盐水重悬沉淀。6.2.3底泥样品：取1g底泥样品，加入5mL无菌生理盐水，涡旋振荡20min，静置10min后，取上清液，4℃、8000r/min离心10min，取上清液备用。6.3核酸提取按照商品化核酸提取试剂盒说明书操作，从预处理后的样品上清液中提取总核酸，同时提取阳性对照、阴性对照、内参对照的核酸（或直接使用标准品）。提取的核酸置于-20℃保存备用，避免反复冻融，使用前室温解冻并涡旋混匀。7检测步骤7.1检测前准备7.1.1实验室环境：检测工作应在超净工作台中进行，工作台及实验器具经紫外线消毒30min以上，避免交叉污染。7.1.2试剂准备：将RPA反应缓冲液、引物探针混合物、酶试剂室温解冻，涡旋混匀后短暂离心，按照试剂盒说明书配制RPA反应液，每反应体系20μL，包括反应缓冲液15μL、引物探针混合物2μL、酶试剂1μL、无酶水2μL。7.1.3芯片准备：取出微流控芯片，检查芯片完整性，无破损、漏液后，置于芯片卡槽中备用。7.2样品加样分别取5μL样品核酸提取物、阳性对照、阴性对照、内参对照，加入对应的RPA反应液中，涡旋混匀后短暂离心，将混合液分别加入微流控芯片的样品池、阳性对照池、阴性对照池、内参对照池，每个样品设置3个平行重复。7.3扩增与检测7.3.1将加样后的微流控芯片放入芯片检测仪，设置反应参数：恒温40℃，反应时间20min，荧光信号采集间隔1min，同时采集FAM、HEX、ROX等多通道荧光信号。7.3.2启动检测程序，仪器自动完成恒温扩增及荧光信号采集，检测结束后自动生成荧光曲线及Ct值报告。8结果判定8.1质量控制判定检测结果需满足以下质量控制要求，否则检测无效，应重新检测：a）阳性对照：5种靶病原对应的荧光通道均出现典型S型荧光曲线，Ct值≤30，表明扩增反应正常，引物探针有效；b）阴性对照：所有荧光通道均无典型S型荧光曲线，Ct值＞38，表明无交叉污染；c）内参对照：对应荧光通道出现典型S型荧光曲线，Ct值≤32，表明样品核酸提取合格，扩增体系无抑制物。8.2样品结果判定在满足质量控制要求的前提下，根据荧光曲线及Ct值判定样品结果：8.2.1阳性：某靶病原对应的荧光通道出现典型S型荧光曲线，Ct值≤35，判定该样品中含有该病原；8.2.2可疑：Ct值在35~38之间，且出现非典型荧光曲线，需重新提取核酸进行复检，复检后Ct值≤38且曲线典型者判定为阳性，否则为阴性；8.2.3阴性：无典型S型荧光曲线，Ct值＞38，判定该样品中不含该病原；8.2.4混合感染：多个靶病原对应的荧光通道均出现典型S型荧光曲线，判定为混合感染。8.3结果表述明确表述样品中检出的病原种类，如“该样品检出白斑综合征病毒（WSSV），未检出桃拉综合征病毒（TSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）、副溶血弧菌”；混合感染时需逐一列出检出的病原。9质量控制9.1人员控制：实验人员应经专业培训，熟悉仪器操作及检测流程，严格按照本文件规定操作，做好个人防护。9.2试剂控制：试剂应在有效期内使用，储存条件符合说明书要求，开封后尽快使用；每次检测均需同时设置阳性对照、阴性对照、内参对照，确保检测结果可靠。9.3仪器控制：微流控芯片检测仪、离心机、移液器等仪器应定期校准，校准周期不少于6个月；使用前检查仪器运行状态，确保正常工作。9.4污染控制：实验过程中严格区分样品处理区、试剂配制区、扩增检测区，避免交叉污染；实验结束后，实验器具经高压蒸汽灭菌（121℃、30min）处理，工作台用75%乙醇擦拭消毒。9.5复检控制：对可疑样品、检测结果异常样品，应重新提取核酸进行复检，必要时采用其他方法（如实时荧光定量PCR）验证，以复检结果为准。10生物安全要求10.1实验室生物安全：检测工作应在符合GB19489规定的二级及以上生物安全实验室进行，实验人员穿戴防护服、口罩、手套、护目镜等个人防护用品，避免直接接触样品及扩增产物。10.2样品及废弃物处理：检测结束后，样品、核酸提取物、扩增产物及废弃实验器具，经高压蒸汽灭菌（121℃、30min）或化学消毒处理（如5%次氯酸钠溶液浸泡30min），符合无害化要求后方可处置。10.3意外处理：若样品或扩增产物接触皮肤、黏膜，应立即用大量清水冲洗，并用75%乙醇消毒；若发生泄漏，应立即用5%次氯酸钠溶液覆盖污染区域，静置30min后清理消毒。10.4疫病报告：检出阳性病原后，应按照《中华人民共和国动物防疫法》规定，及时向当地畜牧兽医行政主管部门和水产技术推广机构报告，配合做好疫病防控和溯源工作。11检测记录与保存11.1检测记录：