羊化脓隐秘杆菌病诊断技术规程

1羊化脓隐秘杆菌病诊断技术规程本文件确立了羊化脓隐秘杆菌病诊断流程，规定了临床检查、实验室检测的操作步骤和判定的要求，描述了过程记录、试验方法等追溯和证实方法。本文件适用于羊化脓隐秘杆菌病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T27401实验室质量控制规范兽医学检测NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羊化脓隐秘杆菌病trueperellapyogenesdiseaseingoat由化脓隐秘杆菌感染羊只引起的以脓肿、化脓性肺炎、乳房炎、子宫内膜炎、关节炎及渐进性消瘦为主要特征的传染病。4基本要求4.1操作人员应熟悉本文件规定的技术流程与操作要点，按规定穿戴防护服、手套、口罩、护目镜等个人防护用品。4.2细菌分离鉴定应在BSL_2实验室开展，并按照NY/T1948要求进行生物安全风险评估与环境消4.3实验室质量控制应符合GB/T27401要求。5诊断流程羊化脓隐秘杆菌病的诊断流程见图1。2图1羊化脓隐秘杆菌感染诊断流程图6临床检查6.1检查方法6.1.1视诊6.1.1.1观察羊只精神状态、被毛粗乱程度及消瘦情况。6.1.1.2观察呼吸频率、呼吸形态及行走姿态，判断有无咳嗽、呼吸急促、关节肿胀、跛行等症状。6.1.1.3观察鼻腔、阴道、乳房等部位有无脓性分泌物、肿胀、破溃、结痂。6.1.2触诊6.1.2.1触摸下颌、肩前、腹股沟等体表淋巴结及皮下组织，检查有无硬结、脓肿、波动感及疼痛反应。36.1.2.2触诊乳房，检查乳区有无红肿、结节、坏死或破溃。6.1.2.3按压腹部及关节，检查有无压痛、肿胀、积液。6.1.3叩诊对胸壁进行叩诊，判断肺部有无浊音区或实音区。6.1.4听诊对肺部进行听诊，判断有无啰音、支气管呼吸音增强或减弱等异常；结合呼吸频率与咳嗽症状，综合评估呼吸系统损伤程度。6.2流行特点6.2.1易感动物不同日龄、品种的羊均可感染，幼龄羊和妊娠期母羊易感性高。6.2.2传染源病羊、带菌羊及被污染的饲料、饮水及用具等。6.2.3传播途径主要经呼吸道、消化道、创伤、昆虫媒介等传播。6.3临床症状6.3.1肺炎型体温升高（40℃~41.5℃),精神沉郁，被毛粗乱，食欲减退或废绝；呼吸急促，出现干咳或湿咳，听诊肺部可闻湿啰音，流黄白色或黄绿色脓性鼻液。6.3.2脓肿型体表淋巴结（下颌、肩前、股前）或皮下组织出现大小不一的脓肿，局部隆起、有波动感，触诊疼痛。脓肿成熟后破溃，流出黄绿色或灰白色、黏稠脓汁，有时混有坏死组织碎片。6.3.3关节炎型多见于膝关节和跗关节等关节肿胀、发热、疼痛，病羊跛行，严重时卧地不起；关节穿刺可抽出浑浊、黄白色脓性关节液。6.3.4子宫内膜炎型阴道流出暗红色或黄白色脓性分泌物，量不等，有恶臭味；母羊表现为屡配不孕、妊娠期流产、发情异常，产后可继发胎衣不下、恶露不尽。6.3.5乳房炎型乳区红肿、发热、质地变硬、接触有痛感，乳汁呈脓性、豆腐渣样、恶臭。严重者乳区皮肤坏死、破溃流脓，泌乳停止，可致永久性泌乳丧失。6.3.6非典型症状4部分病羊可能仅表现轻微发热、精神沉郁、食欲减退、体重下降等非特异性症状，不形成典型脓肿或肺炎等。6.4剖检病变6.4.1肺脏多见大小不等脓肿灶，切面可见脓性渗出物，周边组织充血、出血。6.4.2淋巴结皮质与髓质化脓、坏死，切面呈灰白色脓样或干酪样。6.4.3关节关节囊增厚，滑膜充血、坏死，关节腔内可见脓性渗出液。6.4.4子宫子宫内膜充血、水肿，伴大量炎性细胞浸润，局部坏死、脱落，宫腔内积聚脓性渗出物。6.5结果判定符合以下任一情形，且已排除其他已知病因的，判定为临床疑似病例：a)出现6.3中任一病型的典型临床症状，或经剖检发现6.4中任一典型病变；b)养殖场内存在本病流行史，或病羊接触过病羊、带菌羊及其污染的饲料、饮水、用具等，且出现6.3.6所列非典型临床症状。7实验室检测7.1样品采集与保存7.1.1采样原则采样应符合NY/T541的要求。7.1.2活体动物样品采集7.1.2.1脓汁未破溃脓肿经剪毛、0.5%碘伏消毒后无菌穿刺抽取3mL～5mL；已破溃脓肿采集深部脓汁或脓肿壁组织。7.1.2.2分泌物7.1.2.2.1鼻腔分泌物无菌棉拭子插入鼻腔深部3cm～5cm，转动3圈～5圈取样。7.1.2.2.2阴道分泌物无菌棉拭子采集阴道深部分泌物。7.1.2.2.3乳汁5弃去前三把奶，乳头消毒（0.1%苯扎溴铵溶液）后无菌采集5mL～10mL。7.1.2.3胸腔/关节积液无菌穿刺抽取1mL～2mL，置于灭菌容器中。7.1.2.4血液无菌采集颈静脉血3mL～5mL，室温静置分离血清。7.1.3病死动物样品采集7.1.3.1采集肺、肝、脾、肾、子宫、淋巴结等器官病变组织。7.1.3.2优先采集病变与健康组织交界处的组织块，每块大小约1cm³。7.1.3.3无菌操作抽取胸、腹腔积液及关节积液，分别置于无菌容器中。7.1.3.4病死动物应在死亡后6h内完成采样；若环境温度高于25℃,应在死亡后3h内完成采样。7.1.4保存与运输7.1.4.1采集后12h内能够送达实验室的样本，可放在4℃左右的容器中冷藏运输；不能在12h运输到实验室的样本，应在-20℃以下冷冻后冷藏运输。7.1.4.2样品到达实验室后，应尽快处理；如不能立即进行处理和检测，应置-20℃以下冷冻保存；若需长期保存，应置-70℃超低温冰箱。7.1.4.3采用三层密封包装，内层为灭菌容器、中层为吸水材料、外层为防漏容器，置于加冰袋的保温箱中运输；外包装应标注感染性物质及生物危害标识。7.2细菌分离与鉴定7.2.1接种取病变部位组织及脓汁、胸腔积液、关节液、分泌物、血液等标本，划线接种于5%～10%绵羊血TSA平板（或哥伦比亚绵羊血琼脂平板），37℃培养24h～48h。7.2.2菌落形态见附录A。在绵羊血TSA平板上形成灰白色、圆形、光滑、湿润、半透明、隆起的细小菌落，直径约1mm，菌落周围有清晰的β溶血环。在普通琼脂平板（或不含血的TSA平板）上生长不良或不生长。7.2.3镜检见附录A。革兰氏染色阳性，菌体为多形性短小杆菌，呈栅栏状、V字形或簇状排列。染色方法参照GB/T14926.43。7.2.4生化特性发酵葡萄糖和乳糖产酸；明胶液化试验阳性；甲基红（MR）试验阳性；过氧化氢酶阴性；氧化酶阴性；尿素酶阴性。7.3PCR检测67.3.1基因组提取取组织样品、脓汁、胸腔积液、关节液及培养物，采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作。7.3.2引物上游引物（plo-F）：5'-TTGATAACGGTCCACCACGG-3'；下游引物（plo-R）：5'-CACTGCCACGACCTACAAGT-3'。7.3.3扩增体系20μL体系含2×TaqPCRMasterMix10μL，plo_F、plo_R引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板1μL，用灭菌水补足至20μL。7.3.4扩增程序94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，共30个循环；72℃终延伸3min。7.3.5产物检测PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，恒压120V电泳30min，凝胶成像观察结果。7.3.6结果判定阳性对照在264bp处出现特异性条带、阴性对照无条带为试验有效；样品在264bp处出现条带判为阳性，无条带判为阴性。PCR产物电泳图谱见附录B。7.4荧光定量PCR检测7.4.1引物与探针上游引物（qplo-F5'-GCCAGGATTAGTTGACGGTA-3'；下游引物（qplo-R5'-GACCTTTTCAAATCCG-AGGC-3'；探针（qplo-P）：5'-(HEX)-ACGGCCTTCTCGACGGTTGG-(BHQ1)-3'。7.4.2反应体系20μL体系含2×ProbeqPCRMix10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.8μL，无菌去离子水7.4μL，DNA模板1μL。设阴性对照（无菌水）和阳性对照（已知阳性DNA），500r/min离心30s。7.4.3扩增程序95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，于60℃延伸阶段收集荧光信号。7.4.4结果判定试验有效条件：阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照Ct值≤30.0且出现典型扩增曲线。结果判定：待检样品Ct值≤35.0且出现典型扩增曲线，判为阳性；否则判为阴性。扩增曲线见7.5酶联免疫吸附试验（间接ELISA）检测77.5.1总则相关试剂配制见附录D。7.5.2样品制备待检血清应清亮、无溶血、无污染。56℃灭活30min，分装后-20℃保存。7.5.3抗原制备包被抗原为纯化重组溶血素rPLO，制备方法见附录E。7.5.4抗原包被rPLO包被浓度宜为2μg/mL，用包被稀释液稀释后按100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。7.5.5洗板与封闭弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。每孔加200μL封闭液，37℃孵育2h。7.5.6加样孵育将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清用样品稀释液作1:100稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h。洗涤3次（同7.5.4）。7.5.7二抗孵育加入稀释后的HRP标记的兔抗山羊IgG抗体，100μL/孔，37℃孵育40min～60min，洗涤37.5.8显色与终止每孔加TMB底物溶液100μL，室温避光显色10min，每孔加50μL终止液终止反应。7.5.9结果测定用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度值（OD45₀),终止后15min内完成读数。7.5.10结果判定试验有效条件：阳性对照OD45₀≥1.0，阴性对照OD45₀<0.7。结果判定：S/P＞0.6为阳性；S/P＜0.5为阴性；0.5≤S/P≤0.6为可疑，应对可疑样品重新检测；重测结果如果S/P值小于0.5，则样品应判定为阴性。7.5.11商品化试剂盒的使用经验证符合本文件检测性能要求的商品化间接ELISA试剂盒亦可采用。试剂盒投入使用前应进行性能验证，验证内容至少包括：a)b)采用本文件规定的阳性对照和阴性对照进行测试，其OD45₀7.5.9的要求；对已知阳性、阴性临床样品的检测符合率不低于95%；值及S/P值判定结果应符合8c)验证记录应存档备查。8综合判定8.1疑似病例符合本病流行特点、典型临床症状或病理变化，但无实验室检测依据的，判定为疑似病例。8.2确诊病例满足以下任一条件即可判定为确诊病例：a)从病料中分离到病原菌，且镜检和生化特性符合化脓隐秘杆菌特征；b)普通PCR检测结果阳性；c)荧光定量PCR检测结果阳性；d)间接ELISA血清学检测结果阳性。9档案管理9.1建立检测档案，记录信息包括但不限于样品信息、流行病学资料、临床症状、病理变化、检测方法、试剂耗材、试验数据、结果判定、检测人员及审核人员。9.2档案资料保存期限不少于2年。9（资料性）化脓隐秘杆菌典型图谱参考化脓隐秘杆菌菌落形态参考图见图A.1；化脓隐秘杆菌菌体形态参考图见图A.2。图A.1化脓隐秘杆菌在羊鲜血TSA平板上的菌落形态图A.2化脓隐秘杆菌革兰氏染色镜检结果(×1000）（资料性）PCR产物电泳图谱plo基因PCR产物电泳图见图B.1。M2000bpDNA分子质量图B.1化脓隐秘杆菌plo基因PCR产物电泳判定图荧光定量PCR扩增曲线图荧光定量PCR扩增曲线见图C.1。图C.1化脓隐秘杆菌荧光定量PCR扩增曲线试剂配制D.1本附录所用试验用水应符合GB/T6682的要求。D.2PBS缓冲液（pH7.4称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g，加超纯水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。D.3PBST洗涤液：在1000mLPBS缓冲液中加入0.5mLTween-20，充分混匀，室温保存，有效期1个月。D.4ELISA包被液（碳酸盐缓冲液，pH=9.6）：称取碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g，溶于800mL超纯水，调节pH至9.4~9.6，定容至1000mL，现配现用，使用前经0.22μm滤膜过滤。D.5封闭液（2%BSA-PBST）：称取2.0g牛血清白蛋白（BSA），溶于100mLPBST缓冲液，4℃保存，有效期7d。D.6底物液（TMB显色液）：采用商品化TMB显色液，按说明书避光保存，使用前平衡至室温。D.7终止液（2mol/L硫酸溶液）：缓慢将111mL浓硫酸加入889mL超纯水中，边加边搅拌，室温避光保存，严禁颠倒混合。包被抗原（rPLO）制备E.1基因克隆以化脓隐秘杆菌标准菌株（ATCC49698）基因组DNA为模板，扩增plo基因28位～534位氨基酸编码序列，通过BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶识别位点，克隆至pGEX4T-1载体（图E.1）。E.2诱导表达将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株，经IPTG诱导表达重组蛋白rPLO，培养条件为37℃、180r/min振荡培养4h～6