团体标准 犬类配合饲料中喹诺酮类药物的测定 液相色谱-串联质谱法

团体标准犬类配合饲料中喹诺酮类药物的测定液相色谱-串联质谱法本标准按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。本标准由__________团体提出并归口。本标准起草单位：__________、__________、__________、__________、__________。本标准主要起草人：__________、__________、__________、__________、__________、__________。本标准为首次发布。1范围本标准规定了犬类配合饲料中喹诺酮类药物残留量的测定方法——液相色谱-串联质谱法。本标准适用于犬类配合饲料（包括干粉料、颗粒料、湿拌料、罐头饲料等）中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、达氟沙星等16种喹诺酮类药物残留量的定性鉴别和定量测定。本标准的定量限为：诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等16种喹诺酮类药物均为10.0μg/kg；检出限为3.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1—2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备GB30200饲料中喹诺酮类药物限量JJF1059.1测量不确定度评定与表示JJF1164液相色谱-串联质谱仪校准规范SN/T1626进出口动物源性食品中喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1喹诺酮类药物（Quinolones,QNs）一类人工合成的广谱抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、口服吸收好等特点，本标准特指诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等16种常用于畜禽养殖，可能在犬类配合饲料中残留的喹诺酮类化合物（具体化合物清单见附录A）。3.2检出限（LimitofDetection,LOD）在规定的实验条件下，样品中被测组分产生的信号能与空白样品信号区分开时的最低浓度，本标准中以3倍信噪比（S/N≥3）对应的浓度作为检出限。3.3定量限（LimitofQuantitation,LOQ）在规定的实验条件下，样品中被测组分能够被准确定量测定的最低浓度，本标准中以10倍信噪比（S/N≥10）对应的浓度作为定量限，此时回收率和精密度应符合本标准要求。3.4基质效应（MatrixEffect,ME）犬类配合饲料中的基质成分（如蛋白质、脂肪、碳水化合物等）对喹诺酮类药物的色谱分离和质谱响应产生的抑制或增强作用，本标准采用基质匹配标准曲线法消除基质效应。4原理样品经均质、粉碎后，加入提取溶剂（乙腈-0.1%甲酸溶液），通过涡旋、超声提取喹诺酮类药物，离心后取上清液，经固相萃取柱净化、浓缩、复溶后，采用液相色谱-串联质谱仪进行分离和检测。以保留时间和特征离子对（母离子→子离子）进行定性鉴别，采用基质匹配外标法进行定量计算，通过对比样品与标准品的质谱响应信号，确定样品中喹诺酮类药物的残留量。5试剂与材料除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，实验用水符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂乙腈（CH₃CN）：色谱纯。甲醇（CH₃OH）：色谱纯。甲酸（HCOOH）：色谱纯，纯度≥98%。乙酸铵（CH₃COONH₄）：分析纯，纯度≥99%。0.1%甲酸溶液：量取1.0mL甲酸，用一级水定容至1000mL，摇匀后经0.22μm滤膜过滤，备用。提取溶剂：乙腈-0.1%甲酸溶液（体积比70:30），现配现用。流动相A：0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液，称取0.385g乙酸铵，加入1000mL0.1%甲酸溶液中，溶解后经0.22μm滤膜过滤，超声脱气15min，备用。流动相B：乙腈，经0.22μm滤膜过滤，超声脱气15min，备用。冲洗液：甲醇-水（体积比50:50）。5.2标准品喹诺酮类药物标准品：诺氟沙星（CAS号70458-96-7）、环丙沙星（CAS号85721-33-1）、恩诺沙星（CAS号93106-60-6）等16种标准品，纯度均≥98%，购自国家认可的标准物质供应商，具体清单见附录A。标准储备液（1000μg/mL）：分别准确称取各喹诺酮类药物标准品10.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，置于-20℃冰箱中密封保存，有效期6个月。混合标准中间液（100μg/mL）：准确移取各标准储备液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，置于-20℃冰箱中密封保存，有效期1个月。混合标准工作液：根据实验需要，用空白基质提取液将混合标准中间液逐级稀释成系列浓度的混合标准工作液（如1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L），现配现用。5.3材料与耗材固相萃取柱：C18固相萃取柱（500mg/6mL）或等效柱，使用前用5mL甲醇活化，再用5mL一级水平衡。滤膜：有机相滤膜（0.22μm，直径13mm或25mm）、水相滤膜（0.22μm）。离心管：50mL、10mL，聚四氟乙烯材质，耐有机溶剂。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材质，校准合格。移液管：1mL、2mL、5mL、10mL，玻璃材质或移液器配套吸头，校准合格。氮气：纯度≥99.999%。6仪器与设备下列仪器设备应符合相应标准要求，校准合格并在有效期内使用。液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配备电喷雾离子源（ESI），能够进行正离子扫描和多反应监测（MRM）模式。高速冷冻离心机：转速≥12000r/min，温度可调节（0~4℃）。超声波提取仪：功率≥200W，频率40kHz，可调节温度。涡旋振荡器：转速≥2000r/min，可定时。分析天平：感量0.1mg和0.01g，校准合格。样品均质机：转速≥10000r/min，可用于饲料样品均质粉碎。鼓风干燥箱：控温精度±1℃，用于样品干燥。氮吹仪：温度可调节（室温~80℃），氮气流量可调节，用于样品浓缩。固相萃取装置：真空度可调节（0~0.1MPa），配备固相萃取柱支架。超纯水机：能够制备一级水，符合GB/T6682规定。冰箱：冷藏（0~4℃）、冷冻（-20℃±2℃），用于试剂和样品保存。粉碎机：用于饲料样品粉碎，确保样品粒径均匀。7样品7.1样品采集按照GB/T14699.1的规定进行样品采集，根据犬类配合饲料的种类（干粉料、颗粒料、湿拌料、罐头饲料），选取有代表性的样品，采集量不少于500g，将采集的样品分为两份，一份用于检测，一份作为留样，留样保存于-20℃冰箱中，保存期不少于6个月。采集时应避免样品污染，使用干净、无残留的采样工具，采样后及时密封，标注样品名称、采集日期、采集地点、样品批号等信息。7.2样品制备干粉料、颗粒料：将采集的样品置于洁净的容器中，用粉碎机粉碎，过40目筛，混合均匀，取约20g粉碎后的样品，置于干燥器中备用。湿拌料、罐头饲料：将采集的样品置于均质机中，充分均质，混合均匀，取约20g均质后的样品，置于洁净的离心管中，备用；若样品水分含量过高，可先置于鼓风干燥箱中（40℃±1℃）干燥至恒重，再进行粉碎、过筛处理。7.3样品保存制备好的样品应密封保存，标注相关信息，干粉料、颗粒料样品置于干燥器中，室温保存，保存期不少于7天；湿拌料、罐头饲料样品置于4℃冰箱中，保存期不少于3天；如需长期保存，应置于-20℃冰箱中，密封保存，避免反复冻融。8分析步骤8.1提取准确称取2.00g（精确至0.01g）制备好的样品，置于50mL离心管中，加入20.0mL提取溶剂（乙腈-0.1%甲酸溶液，70:30，v/v），涡旋振荡5min，使样品与提取溶剂充分混合，然后置于超声波提取仪中（30℃±2℃）超声提取20min，超声结束后，将离心管置于高速冷冻离心机中，4℃、10000r/min离心10min，小心吸取上清液，置于另一洁净的50mL离心管中。向剩余的残渣中，再加入15.0mL提取溶剂，重复上述提取、离心步骤，合并两次提取的上清液，摇匀，备用。8.2净化将固相萃取柱（C18，500mg/6mL）安装在固相萃取装置上，先用5mL甲醇活化，再用5mL一级水平衡，待平衡液滴完后，将上述合并的上清液缓慢注入固相萃取柱中，控制流速为1~2mL/min，待样品液全部过柱后，用5mL一级水冲洗柱子，弃去全部流出液，再用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL离心管中。8.3浓缩与复溶将收集的洗脱液置于氮吹仪中，40℃±2℃、氮气流量2mL/min下吹至近干，加入1.0mL基质匹配标准工作液的空白基质提取液（即空白样品按照8.1步骤提取的上清液，经净化、浓缩后，用1.0mL0.1%甲酸-乙腈溶液（30:70，v/v）复溶的溶液），涡旋振荡5min，使残渣完全溶解，然后经0.22μm有机相滤膜过滤，滤液置于进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪检测。8.4空白实验除不加入样品外，其余按照8.1~8.3的步骤进行空白实验，制备空白样品溶液，供检测使用，用于扣除空白干扰。8.5标准曲线的绘制取系列浓度的混合标准工作液（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L），分别注入液相色谱-串联质谱仪中，按照8.6的色谱和质谱条件进行检测，以各喹诺酮类药物的浓度为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y），绘制基质匹配标准曲线，计算回归方程和相关系数（r），要求相关系数r≥0.998。8.6液相色谱-串联质谱条件8.6.1色谱条件色谱柱：C18色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）或等效柱。柱温：35℃。进样量：5μL。流动相：流动相A（0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液），流动相B（乙腈），梯度洗脱程序见表1。时间（min）流动相A（%）流动相B（%）流速（mL/min）0.0~2.075250.32.0~8.075→3025→700.38.0~10.030700.310.0~10.130→7570→250.310.1~15.075250.38.6.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式。监测模式：多反应监测（MRM）。离子源温度：350℃。喷雾电压：4500V。雾化气压力：0.35MPa。干燥气流量：10L/min。碰撞气：氮气，纯度≥99.999%，碰撞气压力0.05MPa。各喹诺酮类药物的MRM参数（母离子、子离子、碰撞能量、驻留时间）见附录B，其中每个化合物选择1个母离子和2个子离子，定量子离子选择响应值最高的子离子，定性子离子选择响应值次高的子离子。8.7样品测定将制备好的样品溶液、空白样品溶液、混合标准工作液，按照8.6的色谱和质谱条件注入液相色谱-串联质谱仪中进行检测，记录各喹诺酮类药物的保留时间和峰面积。若样品溶液中出现与混合标准工作液中某一喹诺酮类药物相同的保留时间（相对偏差≤2.0%），且对应的定性离子对的峰面积比（定性子离子峰面积/定量子离子峰面积）与混合标准工作液中该药物的峰面积比相对偏差≤10%，则可定性判定样品中含有该种喹诺酮类药物；若未出现上述特征，则判定样品中不含该种喹诺酮类药物。9结果计算与表述9.1结果计算采用基质匹配外标法，根据标准曲线回归方程，计算样品中各喹诺酮类药物的浓度，计算公式如下：X=式中：X——样品中某喹诺酮类药物的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；C——由标准曲线回归方程计算得到的样品溶液中该喹诺酮类药物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——样品复溶体积，单位为毫升（mL），本标准中V=1.0mL；f——样品稀释倍数，本标准中未稀释，f=1；m——称取样品的质量，单位为克（g）；1000——单位换算系数。若样品中某喹诺酮类药物的检测浓度低于定量限，则按“未检出”表述；若高于定量限，则按计算结果表述，计算结果保留三位有效数字。9.2结果表述定性结果：明确表述样品中检出或未检出的喹诺酮类药物种类。定量结果：对于检出的喹诺酮类药物，表述其残留量（μg/kg），保留三位有效数字；对于未检出的喹诺酮类药物，表述为“未检出（定量限：10.0μg/kg）”。10精密度与准确度10.1精密度在重复性条件下，对同一空白样品进行3个浓度水平（定量限、2倍定量限、10倍定量限）的加标回收实验，每个浓度水平平行测定6次，各喹诺酮类药物的相对标准偏差（RSD）应满足：定量限水平RSD≤20%，2倍定量限及以上水平RSD≤15%。在再现性条件下，不同实验室对同一标准样品进行测定，各喹诺酮类药物的相对偏差（RD）应≤25%。10.2准确度在空白样品中加入3个浓度水平（定量限、2倍定量限、10倍定量限）的喹诺酮类药物混合标准工作液，按照本标准的分析步骤进行测定，计算加标回收率，各喹诺酮类药物的加标回收率应在70%~120%之间。11检出限与定量限本标准中16种喹诺酮类药物的检出限均为3.0μg/kg（S/N≥3），定量限均为10.0μg/kg（S/N≥10），在定量限水平下，精密度和准确度均符合本标准要求。12不确定度评定按照JJF1059.1的规定，对本方法的测量不确定度进行评定，主要不确定度来源包括：样品称量、标准溶液配制、样品提取、净化、浓缩、仪器测量等环节，不确定度报告应包含各不确定度分量的计算、合成标准不确定度和扩展不确定度，扩展不确定度k=2（置信概率约95%）。当样品中喹诺酮类药物的残留量接近或超过GB30200规定的限量值时，应进行不确定度评定。13质量控制13.1试剂与标准品控制试剂应符合本标准规定的纯度要求，实验前应对试剂进行空白检查，确保无目标物干扰；标准品应购自国家认可的标准物质供应商，具有标准物质证书，标准储备液、中间液、工作液的配制应严格按照本标准要求进行，做好配制记录，定期核查标准溶液的稳定性。13.2仪器控制液相色谱-串联质谱仪应按照JJF1164的规定进行校准，校准合格后方可使用；实验前应对仪器进行调试，确保仪器性能稳定（如色谱柱分离效果、质谱响应强度、重复性等）；实验过程中定期注入混合标准工作液，核查仪器的稳定性，若相对偏差超过10%，应停止检测，查找原因并排除后，重新进行检测。13.3实验过程控制每批样品（不超过20个）应至少设置1个空白样品、1个加标回收样品（加标浓度为2倍定量限），用于监控实验过程的污染和回收率。空白样品中不应检出目标物，若检出目标物，应排查试剂、耗材、仪器等环节的污染，重新进行实验。加标回收样品的回收率应在70%~120%之间，相对标准偏差≤15%，否则该批样品的检测结果无效，应重新进行检测。样品提取、净化、浓缩等环节应严格按照本标准要求进行，控制操作条件（如超声时间、离心转速、氮吹温度等），避免操作误差。13.4数据控制实验数据应及时、准确记录，包括样品信息、试剂信息、仪器参数、标准曲线数据、样品检测峰面积、计算结果等，记录应完整、清晰，可追溯；数据计算应进行复核，确保计算结果准确无误。14安全与防护实验过程中使用的乙腈、甲醇、甲酸等有机溶剂具有挥发性和毒性，应在通风橱中进行操作，佩戴防护手套、防护眼镜、口罩等个人防护用品，避免皮肤接触和吸入。喹诺酮类药物标准品具有毒性，称量和配制时应严格遵守操作规程，避免误食和皮肤接触，剩余的标准品和废弃的标准溶液应按照危险废物管理规定进行处理。实验废弃液（如提取液、洗脱液、过滤液等）应收集在专用的废液容器中，分类存放，按照危险废物管理规定进行处理，严禁随意排放。实验过程中应遵守实验室安全操作规程，注意防火、防爆、防触电，确保实验安全。实验结束后，应及时清理实验台面，清洗实验器具，通风换气，做好实验室卫生。15废弃物处理实验过程中产生的固体废弃物（如样品残渣、用过的固相萃取柱、滤膜等），应收集在专用的固体废弃物容器中，分类存放，按照危险废物管理规定进行无害化处理。实验废弃液（有机溶剂、含药物的废弃液等），应收集在专用的废液桶中，标注废液种类和收集日期，委托有资质的危险废物处理单位进行处理，严禁随意排放。废弃的实验器具（如离心管、容量瓶、移液管等），应清洗干净后，按照实验室废弃物管理规定进行处理，若被药物污染，应按照危险废物处理。16附录附录A（规范性附录）本标准规定的喹诺酮类药物清单序号药物名称英文名称CAS号1诺氟沙星Norfloxacin70458-96-72环丙沙星Ciprofloxacin85721-33-13恩诺沙星Enrofloxacin93106-60-64氧氟沙星Ofloxacin82419-36-15左氧氟沙星Levofloxacin100986-85-46培氟沙星Pefloxacin70458-92-37洛美沙星Lomefloxacin98079-51-78沙拉沙星Sarafloxacin98105-99-89达氟沙星Danofloxacin112398-08-010氟罗沙星Fleroxacin79660-72-311司帕沙星Sparfloxacin110871-86-812依诺沙星Enoxacin74011-58-813诺美沙星NAlmefloxacin101878-46-014环丙沙星盐酸盐CiprofloxacinHydrochloride86483-48-915恩诺沙星盐酸盐EnrofloxacinHydrochloride112732-17-916氧氟沙星盐酸盐OfloxacinHydrochloride824