基于分子尺技术的RNA三维动态解析在功能不明变异解读中的应用进展

基于分子尺技术的RNA三维动态解析在功能不明变异解读中的应用进展【摘要】遗传变异的功能性诠释是精准医学的核心议题。大量“意义未明变异(VUS)”因缺乏改变蛋白质序列的直接证据而难以确权,但可能通过重塑RNA分子的构象系综与能量景观而导致疾病,这一机制超出了线性转录组学的探测维度。本文系统阐述了一种基于非天然碱基对介导的分子尺技术。该方法通过位点特异性标记,结合脉冲电子双共振、单分子荧光共振能量转移和X射线散射干涉等技术,能够在埃至纳米级的空间尺度与纳秒至秒级的时间尺度上精准测定RNA的构象系综与动力学变化。本文论证了遗传变异如何通过改变RNA的能量景观、诱导动力学陷阱或影响翻译速率等物理机制导致功能失调,并探讨了将结构动力学数据转化为美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和分子病理协会(AMP)相关指南中的PS3/BS3级功能证据所面临的挑战。最后,本文提出了一种整合人工智能预测、高通量活细胞化学探针测定、贝叶斯统计评估与分子尺技术验证的分级筛查策略,这一结构动力学分析范式有望为VUS的精准解读提供物理学依据,进而作为新型功能证据支持现有指南的致病性评级,并为靶向RNA药物的开发提供参考。【关键词】意义未明变异;RNA构象动力学;分子尺;非天然碱基对;功能诠释;精准医学1引言意义未明变异(variantsofuncertainsignificance,VUS)指现有证据不足或存在冲突证据、无法明确分类为致病性或良性的变异类型[1]。对VUS的功能解读亟需在序列分析的基础上,进一步获取由这些变异导致的RNA三维结构变化的直接证据。遗传变异可能并不直接截短蛋白导致疾病,还可能通过扰动RNA分子的能量景观,改变RNA构象系综的布局分布,进而影响剪接、翻译及分子稳定性[2-5]。然而,现有的转录组学技术难以捕捉埃(Å)至纳米(nm)尺度的动态构象变化,从而造成大量的VUS滞留于分类盲区。本综述旨在系统阐述由非天然碱基对(unnaturalbasepair,UBP)介导的分子尺技术在VUS功能解读中的应用范式,重点论述该技术如何通过解析RNA构象系综与能量景观,为解读VUS的功能效应提供直接的结构动力学证据。2定量测量RNA三维动态的技术框架2.1UBP介导的位点特异性标记策略突破了长链RNA研究的瓶颈现有方法在标记长度超过200nt的RNA时面临挑战。化学固相合成通常仅适用于<100nt的短链,而酶促末端标记则通常无法高效探查分子内部的长程相互作用[6]。相比之下,基于UBP的体外转录系统允许将包含生物正交反应基团的非天然核苷酸定点掺入任意长度的RNA序列中,随后通过点击化学反应偶联探针[7-8]。该方法已被成功用于解析从97nt短RNA到719nt病毒微基因组RNA复合物的结构域折叠[9],证实了其对于长链RNA研究的普适性。2.2标记策略需在位点特异性与结构扰动之间寻求平衡外源性探针的引入可能通过空间位阻或静电效应改变局部的氢键网络,进而对RNA的局部结构产生微扰[10],尤其在病毒RNA与长链非编码RNA中更容易导致局部构象偏移,影响功能多效性,具体的偏移程度需视体系而定[11]。因此,在实验设计中需引入圆二色谱或功能活性检测以评估结构的完整性。作为互补方案,硫代磷酸酯(phosphorothioate,PS)修饰仅在磷酸骨架上引入原子级变化,对二级结构影响极其轻微。尽管在位点特异性略逊于UBP共转录系统,但在对结构敏感的体系中具有应用优势[12]。2.3多维度分子尺技术可构建从单分子到系综的结构图谱依托特异性标记,3种核心分子尺技术能互补性地解析VUS的结构效应(表1)。脉冲电子双共振(pulsedelectrondoubleresonance,PELDOR),亦称双电子-电子共振(doubleelectron-electronresonance,DEER)擅长测量1.5~16nm的长程距离分布,适用于量化VUS引起的构象异质性及不同构象态的布局比例变化[9]。单分子荧光共振能量转移(singlemoleculeFRET,smFRET)具备高时间分辨率,能够实时追踪单分子水平的构象转换速率,从而揭示VUS对折叠路径和瞬态中间体的动力学影响[13]。X射线散射干涉(X-rayscatteringinterferometry,XSI)则利用重原子探针提供0.5~50nm的绝对距离约束,适用于测定超大分子复合物中由VUS诱导的全局拓扑结构改变[14](图1)。3RNA构象动态失调与疾病发生的机制关联3.1分子尺技术已具备解析复杂RNA动态行为的方法学基础分子尺技术的可行性已在若干生物分子系统中得到了初步验证。例如,smFRET技术已成功捕捉到黄病毒长链非编码RNA在接近生理条件和Mg2+浓度依赖下的折叠中间态,并成功量化了特定碱基突变对结构稳定性的热力学影响[7]。这项研究为基于分子尺技术的人类遗传病相关的RNA研究提供了方法论参考。3.2蛋白编码基因中的VUS可能通过影响翻译动力学致病同义突变型VUS的致病机制可能不依赖蛋白序列改变,而是通过引入非最优密码子减慢翻译延伸速率,进而促进mRNA降解,最终导致疾病的发生[15]。若VUS诱导形成稳定的茎环结构,可能导致与RNA结合的核糖体长时间停滞,即便未触发无前进降解(no-godecay,NGD)通路,也可能降低蛋白合成通量,导致功能性蛋白表达不足[16]。因此,分子尺技术通过构象转变能垒变化的定量,有望为区分仅影响翻译效率的RNA高级结构及无显著功能影响的同义突变提供一组物理化学参数。3.3RNA构象系综的偏移为RNA相关遗传病提供了直接病理证据RNA分子结构动力学的改变可能是多种遗传病的分子机制之一。这种构象平衡的偏移可能影响RNA的剪接调控。例如,在脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)中,小分子药物利司扑兰(Risdiplam)能够通过稳定SMN2前体mRNA剪接调控区的特定功能构象,促进第7外显子的正确纳入[17]。类似地,研究者在与神经发育障碍相关的剪接体U4和U5snRNA基因中,观察到新发(denovo)变异倾向于聚集在茎环、假结等结构域,推测其可能通过干扰U4/U6或U5的精确相互作用而影响5'剪接位点的识别与外显子对齐,从而揭示了非编码snRNA动态失调的一种潜在的致病机制[18]。除影响剪接过程外,构象动力学的改变亦可能直接调控RNA的生物学活性。在先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)中,除由PARN基因内含子变异导致的外显子跳跃和无义介导的mRNA降解路径外[19],smFRET针对人端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)的分析显示,hTR假结区一个2nt的非互补突变虽未导致RNA降解,但显著降低了假结区的折叠速率常数,导致构象平衡向非功能性的发夹结构偏移,这也许能够解释其破坏端粒酶活性的机理[20]。异常的RNA构象还可能通过改变与蛋白质的相互作用而致病。在强直性肌营养不良1型(myotonicdystrophytype1)中,DMPK基因3'非翻译区的CUG重复序列异常扩展,形成具有毒性的RNA发夹结构,成为动态构象陷阱,隔离MBNL1等剪接因子,继而导致下游的剪接异常[21]。上述案例表明,VUS的致病性可能并不总是体现在静态结构的完全破坏,而是构象系综中不同功能状态之间平衡常数或动力学速率常数的改变上。4结论与展望由分子尺技术获得的构象系综布局比例、折叠/展开速率常数等构象系综参数,可以分别从埃至纳米级的空间尺度与纳秒至秒级的时间尺度直接捕捉RNA在溶液状态下的隐藏构象状态与瞬态能量景观[6-7,15]。对于这类动态构象信息的获取,将为揭示VUS导致功能失调的机制提供结构动力学维度的证据支持[2,11]。因此,由分子尺技术获得的构象系综参数有望作为一种新型功能证据,为完善现有美国医学遗传学与基因组学学会(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics,ACMG)和分子病理协会(AssociationforMolecularPathology,AMP)指南中VUS的功能性评级提供参考。然而,将分子尺技术获得的数据向临床标准证据转化仍面临一定的挑战。首先,体外功能实验的结果不能直接被用于临床评级。根据临床基因组资源(ClinicalGenomeResource,ClinGen)推荐的序列变异解读框架,体外功能实验的结果需要被转换为致病性的可能概率(oddsofpathogenicity,OddsPath)[22]。其次,RNA分子具有功能异质性,而非编码区目前仍缺乏已确立的已知致病与良性变异(well-establishedknownpathogenicandbenignvariants)作为统计校准的参考集。这就意味着难以将获得的物理化学参数用于判定变异的致病性[4-5]。针对这一问题,未来的研究可以尝试借鉴药理学中的剂量与效应曲线原理,构建构象物理参数与下游生化反应及细胞表型的定量关联曲线[15-16],探讨微观构象布局倾向的能量变化与细胞生理活性指标受损程度之间的映射关系,进而推导出RNA分子功能异常的物理参数的临界值[23]。此外,分子尺技术本身也存在应用的限制。该技术对样品制备要求严格、检测周期较长、并且依赖EPR波谱仪和单分子荧光显微镜等专业设备。由于单一的分子尺技术难以满足临床转化的需求,采用计算生物学预测、高通量生化实验与单分子精密测量相结合的分级筛查策略可能是分子尺技术临床转化的一条可行路径[24-25]。该策略可首先利用整合了大规模数据集的RiNALMo、NuFold等RNA人工智能算法模型对VUS进行计算评估,筛选出具有较高三维结构改变风险的候选变异,并将预测评分作为计算与预测辅助证据(computationalandpredictiveevidence,PP3)[26-27]。随后,针对参考集相对匮乏的困境,可以引入多重变异效应分析(multiplexedassaysofvarianteffects,MAVEs)框架[28],高通量评估变异的功能影响。该方法在构建包含突变的质粒文库时,需要将研究靶标或同源结构域中已明确临床分类的致病与良性变异作为内部基准预先掺入文库中[29]。之后,再将该突变质粒文库转染至宿主细胞,并在活细胞中运用细胞内选择性羟基酰化分析结合突变图谱(in-cellselective2'-hydroxylacylationanalyzedbyprimerextensionandmutationalprofiling,In-cellSHAPE-MaP)或硫酸二甲酯结合突变图谱测序(dimethylsulfatemutationalprofilingwithsequencing,DMS-MaPseq)为代表的高通量生化探针技术,在同一实验体系内平行绘制文库中变异的局部构象柔性变化图谱[30-32]。在获取这类生化探测数据后,需要将其转化为OddsPath。由于生化探针获取的突变效应图谱表现为连续的数值,研究者可使用贝叶斯统计校准模型,依据上述的预先掺入文库的基准数据分布特征,将测定的VUS的生化数值转换为OddsPath,从而完成对VUS所处RNA结构域突变耐受度的定量定标[3,33]。最后,对于在高通量生化探测中得分处于临界值附近或涉及关键药物靶点的VUS,利用分子尺技术在体外进行结构动力学参数的精准测定,可望与原位探测的结果形成相互印证的跨尺度证据[9,12,20,33]。在多维数据整合阶段,可以通过评估细胞内生化网络对突变能量损失的代偿能力,为准确判断变异的真实致病性提供关键参考[3,33]。若体外测得VUS从非活性构象向活性构象转变所需的能量超过了细胞内相关核糖核酸结合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)网络所能够提供的结合自由能代偿的上限,则可以在一定程度上推断细胞难以通过诱导契合机制纠正该突变造成的构象扰动,从而提高多维数据整合预测体内真实构象状态的可靠性。综上所述,以分子尺技术的三维动态解析为核心、整合了计算模型预筛、高通量活细胞化学探针测定、贝叶斯统计评估的结构动力学分析范式,可能有助于在一定程度上填补基因型与表型之间的认知空白,为VUS的精准解读提供客观的物理依据,有望作为新型功能证据支持ACMG/AMP指南的致病性评级,并为靶向RNA的药物开发提供参考。参考文献[1]RichardsS,AzizN,BaleS,etal.Standardsandguidelinesfortheinterpretationofsequencevariants:AjointconsensusrecommendationoftheAmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomicsandtheAssociationforMolecularPathology[J].GenetMed,2015,17(5):405-424.DOI:10.1038/gim.2015.30.[2]GanserLR,KellyML,HerschlagD,etal.TherolesofstructuraldynamicsinthecellularfunctionsofRNAs[J].NatRevMolCellBiol,2019,20(8):474-489.DOI:10.1038/s41580-019-0136-0.[3]TsaiCJ,NussinovR.Aunifiedviewof"howallosteryworks"[J].PLoSComputBiol,2014,10(2):e1003394.DOI:10.1371/journal.pcbi.1003394.[4]SoemediR,CyganKJ,RhineCL,etal.Pathogenicvariantsthatalterproteincodeoftendisruptsplicing[J].NatGenet,2017,49(6):848-855.DOI:10.1038/ng.3837.[5]KremerLS,BaderDM,MertesC,etal.GeneticdiagnosisofMendeliandisordersviaRNAsequencing[J].NatCommun,2017,8(1):15824.DOI:10.1038/ncomms15824.[6]ShiX,BonillaS,HerschlagD,etal.QuantifyingnucleicacidensembleswithX-rayscatteringinterferometry[J].MethodsEnzymol,2015,558:75-97.DOI:10.1016/bs.mie.2015.02.001.[7]ZhangJ,FangX.EmpoweringthemolecularrulertechniqueswithunnaturalbasepairsystemtoexploreconformationaldynamicsofflaviviralRNAs[J].CurrOpinStructBiol,2024,89:102944.DOI:10.1016/j.sbi.2024.102944.[8]WangY,KathiresanV,ChenY,etal.Posttranscriptionalsite-directedspinlabelingoflargeRNAswithanunnaturalbasepairsystemundernon-denaturingconditions[J].ChemSci,2020,11(35):9655-9664.DOI:10.1039/d0sc01717e.[9]WangY,ChenY,HuY,etal.Site-specificcovalentlabelingoflargeRNAswithnanoparticlesempoweredbyexpandedgeneticalphabettranscription[J].ProcNatlAcadSciUSA,2020,117(37):22823-22832.DOI:10.1073/pnas.2005217117.[10]PitonN,MuY,StockG,etal.Base-specificspin-labelingofRNAforstructuredetermination[J].NucleicAcidsRes,2007,35(9):3128-3143.DOI:10.1093/nar/gkm169.[11]LeeYT.NexusbetweenRNAconformationaldynamicsandfunctionalversatility[J].CurrOpinStructBiol,2024,89:102942.DOI:10.1016/j.sbi.2024.102942.[12]HuY,WangY,SinghJ,etal.Phosphorothioate-basedsite-specificlabelingoflargeRNAsforstructuralanddynamicstudies[J].ACSChemBiol,2022,17(9):2448-2460.DOI:10.1021/acschembio.2c00199.[13]LernerE,CordesT,IngargiolaA,etal.Towarddynamicstructuralbiology:Twodecadesofsingle-moleculeFörsterresonanceenergytransfer[J].Science,2018,359(6373):eaan1133.DOI:10.1126/science.aan1133.[14]LeeS,KiH,LeeSJ,etal.Single-moleculeX-rayscatteringusedtovisualizetheconformationdistributionofbiologicalmoleculesviasingle-objectscatteringsampling[J].IntJMolSci,2023,24(24):17135.DOI:10.3390/ijms242417135.[15]PresnyakV,AlhusainiN,ChenYH,etal.CodonoptimalityisamajordeterminantofmRNAstability[J].Cell,2015,160(6):1111-1124.DOI:10.1016/j.cell.2015.02.029.[16]VeltriAJ,D′OrazioKN,LessenLN,etal.DistinctelongationstallsduringtranslationarelinkedwithdistinctpathwaysformRNAdegradation[J].Elife,2022,11:e76038.DOI:10.7554/eLife.76038.[17]CampagneS,BoignerS,RüdisserS,etal.StructuralbasisofasmallmoleculetargetingRNAforaspecificsplicingcorrection[J].NatChemBiol,2019,15(12):1191-1198.DOI:10.1038/s41589-019-0384-5.[18]NavaC,CogneB,SantiniA,etal.DominantvariantsinmajorspliceosomeU4andU5smallnuclearRNAgenescauseneurodevelopmentaldisordersthroughsplicingdisruption[J].NatGenet,2025,57(6):1374-1388.DOI:10.1038/s41588-025-02184-4.[19]AkimovaD,SemenovaN,CherevatovaT,etal.RNAanalysisuncoverspathogenicPARNvariantindyskeratosiscongenita[J].ClinGenet,2026,109(2):346-351.DOI:10.1111/cge.70037.[20]HolmstromED,NesbittDJ.Single-moleculefluorescenceresonanceenergytransferstudiesofthehumantelomeraseRNApseudoknot:Temperature-/Urea-dependentfoldingkineticsandthermodynamics[J].JPhysChemB,2014,118(14):3853-3863.DOI:10.1021/jp501893c.[21]WangKW,RiverosI,DeLoyeJ,etal.DynamicdockingofsmallmoleculestargetingRNACUGrepeatscausingmyotonicdystrophytype1[J].BiophysJ,2023,122(1):180-196.DOI:10.1016/j.bpj.2022.11.010.[22]BrnichSE,AbouTayounAN,CouchFJ,etal.RecommendationsforapplicationofthefunctionalevidencePS3/BS3criterionusingtheACMG/AMPsequencevariantinterpretationframework[J].GenomeMed,2019,12(1):3.DOI:10.1186/s13073-019-0690-2.[23]StelzerAC,FrankAT,KratzJD,etal.DiscoveryofselectivebioactivesmallmoleculesbytargetinganRNAdynamicensemble[J].NatChemBiol,2011,7(8):553-559.DOI:10.1038/nchembio.596.[24]MuK,FeiY,XuY,etal.RASPv2.0:anupdatedatlasforRNAstructureprobingdata[J].NucleicAcidsRes,2025,53(D1):D211-D219.DOI:10.1093/nar/gkae1117.[25]BustamanteA,CarrocciTJ,NicholsonDA,etal.NascentRNAfoldingandRNPassemblyrevealedbysingle-moleculemicroscopy[J].JMolBiol,2026,438(1):169365.DOI:10.1016/j.jmb.2025.169365.[26]PenićRJ,VlašićT,HuberRG,etal.RiNALMo:General-purposeRNAlanguagemodelscangeneralizewellonstructurepredictiontasks[J].NatCommun,2025,16(1):5671.DOI:10.1038/s41467-025-60872-5.[27]KagayaY,ZhangZ,IbtehazN,etal.NuFold:End-to-endapproachforRNAtertiarystructurepredictionwithflexiblenucleobasecenterrepresentation[J].NatCommun,2025,16(1):881.DOI:10.1038/s41467-025-56261-7.[28]WeileJ,RothFP.Multiplexedassays