枸杞干果中5种有机酸的测定 液相色谱-串联质谱法

枸杞干果中5种有机酸的测定液相色谱-串联质谱法1范围本规程规定了采用液相色谱-串联质谱法测定枸杞干果中5种有机酸（柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸）含量的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器设备、样品处理、色谱-质谱条件、测定步骤、结果计算、精密度、准确度及注意事项。本规程适用于各类枸杞干果中上述5种有机酸的定量测定，检出限、定量限满足痕量检测需求，其他浆果类干果可参照执行。枸杞干果需符合GB/T18672-2002《枸杞(枸杞子)》相关要求，确保样品无霉变、无二氧化硫超标等问题。2术语和定义有机酸：本规程特指枸杞干果中天然存在的柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸，均为水溶性有机酸，具有特定的化学结构和质谱裂解特征，是枸杞风味和营养价值的重要组成部分。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）：将高效液相色谱的高效分离能力与串联质谱的高灵敏度、高选择性检测能力相结合，通过液相色谱实现样品中目标组分与基质杂质的分离，再经串联质谱进行离子化、裂解，根据特征母离子和子离子进行定性，外标法峰面积定量的分析方法。母离子：目标化合物分子在离子源中失去或获得电子形成的分子离子峰，具有特定的质荷比（m/z），是串联质谱定性的基础。子离子：母离子在碰撞室中与碰撞气体发生裂解反应后产生的碎片离子，具有特征性的质荷比，用于进一步确认目标化合物，提高检测的准确性和选择性。回收率：样品中添加已知量的5种有机酸标准物质后，经前处理和检测，实际测得的标准物质含量与添加量的比值，用于评价方法的准确度。精密度：在相同实验条件下，对同一均匀样品进行多次重复检测，测定结果的离散程度，通常用相对标准偏差（RSD）表示。3原理枸杞干果中的柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸经超纯水提取、超声辅助溶解后，通过离心、滤膜过滤去除样品中的大分子杂质、色素及不溶性颗粒物，实现样品净化。采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶或亲水作用色谱柱为固定相，适宜的缓冲液-有机相为流动相，对净化后的提取液进行洗脱分离，使5种有机酸与样品基质中的干扰组分有效分离。分离后的目标组分进入串联质谱仪，采用电喷雾负离子源（ESI⁻）电离，选择反应监测模式（SRM）进行检测，根据各有机酸的特征母离子、子离子及保留时间进行定性确认；以标准系列溶液的峰面积对浓度绘制标准曲线，采用外标法计算样品中5种有机酸的含量。该方法可有效规避基质干扰，提高检测灵敏度和准确性，满足痕量水平的定量要求。4试剂与材料4.1试剂除非另有说明，所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（电导率≤18.2μS/cm，25℃）；流动相所用有机相为色谱纯，缓冲盐试剂为优级纯。柠檬酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。苹果酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。草酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。琥珀酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。酒石酸标准品（纯度≥99.5%）：编号、批号清晰，置于干燥密封容器中常温保存。甲醇（CH₃OH）：色谱纯，用于配制流动相和标准溶液。乙腈（CH₃CN）：色谱纯，用于配制流动相，改善分离效果。甲酸（HCOOH）：优级纯，用于调节流动相pH值，优化离子化效率。乙酸铵（CH₃COONH₄）：优级纯，用于配制流动相缓冲液，提高分离选择性。氨水（NH₃·H₂O）：优级纯，浓度25%～28%，用于调节样品提取液pH值（如需）。4.2试剂配制甲酸溶液（0.1%，v/v）：量取1mL甲酸，缓慢加入999mL超纯水中，搅拌均匀，经0.22μm有机相滤膜过滤后备用，用于流动相配制和标准溶液稀释。乙酸铵缓冲液（10mmol/L）：称取0.7708g乙酸铵，加适量超纯水溶解，冷却后定容至1000mL，搅拌均匀，用甲酸微调pH至3.0～3.5，经0.22μm有机相滤膜过滤后备用。混合标准储备液：分别精密称取柠檬酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、酒石酸标准品各10.0mg，置于同一个100mL容量瓶中，加少量超纯水溶解，用0.1%甲酸溶液定容至刻度，摇匀，得到浓度为100μg/mL的5种有机酸混合标准储备液，4℃冷藏保存，有效期1个月，避免微生物污染。混合标准工作液：精密量取混合标准储备液适量，用0.1%甲酸溶液逐级稀释，配制浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的混合标准工作液，现配现用，避免长时间放置导致浓度偏差。流动相：甲醇-10mmol/L乙酸铵缓冲液（10:90，v/v），或乙腈-0.1%甲酸溶液（8:92，v/v），根据色谱分离效果可适当调整比例，使用前超声脱气15min（功率200W，频率40kHz），去除气泡避免影响检测。4.3材料滤膜：0.22μm、0.45μm有机相滤膜，用于流动相、标准溶液和样品提取液过滤，去除微小杂质。离心管：50mL、10mL，聚四氟乙烯材质，耐酸耐碱，适合高速冷冻离心。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材质，精度符合A级要求，用于标准溶液和样品提取液定容。样品瓶：2mL棕色样品瓶，带聚四氟乙烯垫片，用于储存样品提取液和标准工作液，避免光照影响。移液管：1mL、2mL、5mL、10mL，精度符合A级要求，用于试剂和标准溶液移取。离心管垫：耐高温、耐腐蚀性材质，用于离心管密封，防止离心过程中液体渗漏。5仪器设备液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI），具备高压输液系统、柱温箱、自动进样器、串联质谱检测器，性能稳定，能实现选择反应监测模式（SRM）检测，符合相关仪器检定规程要求。分析天平：精度0.1mg和0.001g，用于样品和标准品称量，定期校准确保精度。高速冷冻离心机：转速≥10000r/min，温度可调节（0～4℃），用于样品提取液离心净化，去除不溶性杂质。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz，温度可调节，用于样品提取辅助溶解，避免高温破坏目标组分。pH计：精度±0.01，用于调节试剂和样品提取液的pH值，定期校准。粉碎机：用于枸杞干果粉碎，粉碎后过40目筛，确保样品均匀，避免交叉污染。烘箱：控温精度±1℃，温度范围30～100℃，用于样品干燥（如需），去除多余水分。超纯水机：能制备电导率≤18.2μS/cm（25℃）的超纯水，满足实验用水需求。超声脱气机：用于流动相脱气，去除气泡，避免影响色谱分离效果和检测灵敏度。涡旋振荡器：转速可调节，用于样品提取液和标准溶液的摇匀，确保混合均匀。6样品处理6.1样品制备取枸杞干果样品，去除杂质、破损颗粒及霉变个体，置于烘箱中60℃干燥至恒重（若样品水分含量≤12%，可直接粉碎），冷却至室温后，用粉碎机粉碎，过40目筛，充分混匀，置于干燥密封容器中保存，避免吸潮和污染，备用。制备好的样品应在24h内完成前处理，避免有机酸降解。6.2样品提取精密称取制备好的枸杞干果粉末2.000g，置于50mL离心管中，加入25mL超纯水，涡旋振荡5min，使样品充分分散；置于超声波清洗器中，30℃、200W、40kHz超声提取20min，期间每隔5min涡旋振荡1次，确保提取充分，避免局部提取不彻底。超声提取完成后，取出冷却至室温，用超纯水补足至25mL（弥补超声过程中挥发的水分），涡旋摇匀，静置10min。6.3样品净化将上述静置后的样品溶液转移至高速冷冻离心机中，10000r/min、4℃离心15min，取上清液，经0.45μm有机相滤膜过滤，弃去初滤液（约1mL），取续滤液；将续滤液经0.22μm有机相滤膜再次过滤，去除微小杂质和胶体颗粒物，避免堵塞色谱柱和污染质谱检测器。过滤后的续滤液置于2mL棕色样品瓶中，避光保存，待LC-MS/MS检测。若样品基质干扰较大（色素、多糖含量较高），可在离心后取上清液，用0.1%甲酸溶液适当稀释后再过滤检测。7色谱-质谱条件7.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（HypersilODS2,250mm×4.6mm，5μm），或亲水作用色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），或其他等效色谱柱，确保5种有机酸实现有效分离，分离度≥1.5。流动相：甲醇-10mmol/L乙酸铵缓冲液（10:90，v/v）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；洗脱方式：等度洗脱，洗脱时间20min，可根据分离效果适当调整洗脱时间。备注：若5种有机酸分离效果不佳，可调整流动相比例为乙腈-0.1%甲酸溶液（8:92，v/v），或采用梯度洗脱模式，优化分离条件。7.2质谱条件离子源：电喷雾负离子源（ESI⁻）；电离电压：-4500V；离子源温度：350℃；雾化气压力：0.35MPa；干燥气流量：10L/min；碰撞气：氮气（纯度≥99.999%）；检测模式：选择反应监测模式（SRM）。5种有机酸的特征母离子、子离子及碰撞能量（参考值）见表1，可根据仪器性能适当优化碰撞能量、驻留时间等参数，确保检测灵敏度和定性准确性。序号有机酸名称母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量（eV）保留时间（min，参考值）1草酸8945153.22酒石酸14989184.53苹果酸13389165.84琥珀酸11773147.35柠檬酸191111208.9注：表中保留时间和碰撞能量为参考值，实际检测时需根据仪器型号、色谱柱性能进行优化校准。8测定步骤8.1仪器校准与调试开启液相色谱-串联质谱仪，按照仪器操作规程进行预热（预热时间≥30min），调试仪器各项参数（流动相流速、柱温、离子源温度、电离电压等），直至仪器运行稳定，基线平稳（基线噪声≤0.01mV），满足检测要求。8.2标准曲线绘制将配制好的系列浓度混合标准工作液（0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL），按浓度由低到高的顺序依次进样，按照上述色谱-质谱条件进行检测，记录每种有机酸的峰面积。以各有机酸的浓度（μg/mL）为横坐标（x），对应的峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数（r）。要求相关系数r≥0.999，否则需重新配制标准工作液，重新绘制标准曲线。8.3样品测定将净化后的样品提取液，按照上述色谱-质谱条件进行进样检测，记录每种有机酸的峰面积。若样品提取液中某有机酸的峰面积超出标准曲线的线性范围，需用0.1%甲酸溶液适当稀释后再进样检测，稀释倍数需准确记录，用于后续结果计算。8.4空白实验除不加入枸杞干果样品外，其余操作均按照6.2、6.3节样品处理步骤和8.3节测定步骤进行空白实验，记录空白溶液中5种有机酸的峰面积。若空白溶液中出现目标组分的峰，需排查试剂、实验器具、环境等干扰因素，重新进行实验。8.5平行实验对同一枸杞干果样品，平行制备3份样品提取液，分别进行检测，记录每种有机酸的峰面积，计算平行测定结果的相对标准偏差（RSD），用于评价方法的精密度。8.6回收率实验取已知含量的枸杞干果样品，精密称取3份，分别加入适量的混合标准储备液，使添加浓度分别为低、中、高三个水平（低水平：0.5μg/g，中水平：5.0μg/g，高水平：10.0μg/g），按照6.2、6.3节样品处理步骤和8.3节测定步骤进行检测，计算回收率，评价方法的准确度。9结果计算与表示9.1结果计算根据样品提取液中各有机酸的峰面积，代入对应有机酸的标准曲线回归方程，计算样品提取液中该有机酸的浓度（μg/mL），再按下列公式计算枸杞干果中该有机酸的含量：X=式中：X——样品中某有机酸的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）；C——由标准曲线计算得到的样品提取液中该有机酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；C₀——空白溶液中该有机酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——样品提取液的定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品提取液的稀释倍数（未稀释时f=1）；m——称取样品的质量，单位为克（g）；1000——单位换算系数（1mg=1000μg）。平行测定3份样品，计算测定结果的平均值，作为样品中该有机酸的最终含量，计算结果保留两位小数。9.2结果表示样品中5种有机酸的含量分别以测定平均值表示，若某有机酸的测定值低于方法检出限，则表示为“未检出（ND）”，并注明该有机酸的检出限。10精密度与准确度10.1精密度同一枸杞干果样品平行测定6次，5种有机酸测定结果的相对标准偏差（RSD）应≤5.0%，否则需排查实验操作、仪器状态等因素，重新进行测定。10.2准确度低、中、高三个添加水平的回收率应在85.0%～115.0%之间，相对标准偏差（RSD）≤6.0%，确保方法的准确度满足检测要求。11检出限与定量限本方法中5种有机酸的检出限（LOD）为0.01μg/g～0.05μg/g，定量限（LOQ）为0.03μg/g～0.15μg/g，具体检出限和定量限可根据仪器性能、样品基质进行校准。当样品中某有机酸的测定值≥定量限时，可准确定量；当测定值在检出限～定量限之间时，需注明“检出但未定量”；当测定值＜检出限时，表示为“未检出（ND）”。12注意事项标准品应妥善保存，混合标准储备液4℃冷藏有效期为1个月，混合标准工作液现配现用，避免长时间放置导致浓度偏差；草酸标准品易吸潮，称量时应快速操作，避免吸潮影响称量精度。实验所用器具（离心管、容量瓶、样品瓶等）需用超纯水反复清洗3次以上，晾干后使用，避免残留杂质干扰检测结果；色谱