高考生物-PCR技术与应用（含解析）

PCR技术与应用

鱼核心提炼

聚合前链式反应的缩写，根据DNA

半保留复制的原理,在体外快速扩

原理

增目的基因

DNA模板、2种引物、4种脱毓核甘酸

舔件）一和耐高温的DNA聚合酶、缓冲液（含

Mg2+）

本质：是一小段能与DNA母链的一段

PCR碱基序列互补配对的知单链核酸

技术

作用：使DNA聚合酶能够从引物的3,端

开始连接脱氧核甘酸

变性（超过9。七）一复性（5。七左右）一

延伸（72七左右）

原理：DNA可带电荷，在电场

产物鉴定：中会向相反的电极移动

琼脂糖凝

迁移速率：与凝陵的浓度、DNA

胶电泳

分子的大小和构象等有关

鱼典例突破

一、PCR技术“弓|物”归类分析

1.引物的设计

（1）（2020・山东，25节选）通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出以基因的cDNA,原因是

答案引物是根据M基因的•段己知序列设计合成的（或引物能与以基因的cDNA特异性结合）

（2）（经典高考题节选）设计引物时需要避免引物之间发生__________，而造成引物自连。同理也要避免引物之间的互

补。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同且的引物需要设定更高的复性温度。

答案碱基互补配对G、C含量高

（3）科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，

收获的目的基因较少，原因是_______________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是

答案引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离（影响变性）引物过短导致引物的特异性下降

拓展引物与复性温度

（1）复性温度：复性温度高，扩增特异性强；复性温度低，扩增效率高。

（2）引物：①引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；

②引物GC含量越高，容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。

2.引物的修饰

（1）（2022.山东，25节选）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酸识别并降解，药物A可通过影

响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和

FLAG-PAoP△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有

FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PA的功能。

①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是

为使PCR产物能被限制酹切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酹识别序列应添加在引物的

______啰“3'端”或"5’端”）。

②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中

“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出

的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是

修改扩增P基因时使用的带有EcoRI识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是

DNA编码ATGGAC--AAGGCGAATTCATGTGCA-GGATCC

链氨基Met|Asp…L天AlaAsnSerCysAlaGlySer

酸序列FLAG

注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补转

答案①能与P基因模板链3'端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸5,端②P基因编码链的第-个碱基与

EcoRI识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的EcoRI识别序

列3'端添加1个碱基

解析①引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单镂核酸，因此设计扩增P基因的引物，需要

两种引物分别与两条模板链3'端的诚基序列互补。DNA聚合酶延仲时，是将脱氧核昔酸加到引物的3'端，为了

不破坏目的基因，该限制畴识别序列应添加在引物的5'端。②融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合

蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在

转录出的mRNA中，限制晦识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码

框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在石I识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的

碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。

（2）引物用PCR技术将DNA分子中的Ai片段进行扩增，设计了引物【、II,其连接部位如图所示，X为某限制酶

识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的（）

拼F^X

Q,Al片段J______

**mnn.

XX

_______

IIIIIIIIIIIIIIIIIiuniiiuiiiiiiIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

f-A)^—1I—A!^—1f^A|1J—A|^—1

ABCD

答案D

解析在第一次PCR循环结束后，得到以引物I【延长得到的单链。在以后的PCR循环中，以引物H所形成的单链

为模板在引物I的作用下合成DNA时，引物H上的X片段也被作为模板合成子链。因为两条引物间的片段以指数

倍数犷噌，实验结束得到的绝大部分DNA片段是选项中的Do

3.引物的结合方向

如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：

0-ATGCCGTAAGTCCTACTGTAAGCCGTAGATCA-OH

HO-氧嵇166人牝公屋抑d法&狼'以群一@

扩增X蛋白基因所需的引物序列是

答案5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3f5'-TGATCTACGGCTTACA-3z

解析书写引物序列，一般从引物的5'端向3'端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5'端磷酸基团在左侧，

3'端羟基在右侧，可知与上方模板就配对的引物5'端在右侧，3'端在左侧，引物序列为

5f-TGATCTACGGCTTACA-3f。同理推测另外一条引物的序列。

4.引物的数量计算

(1)如图：一个DNA分子〃次扩增，则：

第一轮第二轮第三轮

,引物I。引物2--一新形成的子链

①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为个；

②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为个；

③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为个：

④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为个；

⑤复制过程中共需引物个；

⑥第〃次复制需要引物个。

(2)已知引物I及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第轮循环产物中

开始出现两条单链等长的目的片段。

弓I物1・

匚二］引物2

引物与DNA的结合位点图

答案⑴①2〃一2〃②2〃③2④2"-1

⑤2"+1一2⑥2"（2）2

二、PCR产物鉴定——琼脂糖凝胶电泳

（2024.黑吉辽，7）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（）

A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小

B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置

C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快

D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来

答案A

解析凉脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的

DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，

因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度

的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂

前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误：DNA片段的迁移速率与其大小成

反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，DNA迁移方向为从负极向正极，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与

其中的核酸染料结合后，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。

三、常用PCR技术及原理

1.利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式

为鉴定稀选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图中A所示为甲、乙、

丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是o某学生尝试用图中另外一对

引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是

答案乙和丙目的基因反向连接

解析如图A所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引

物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450bp片段。根据图B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因

反向连接会扩增出400bp片段。

2.利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变

如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变（A/T碱基对变为G/C）的过程。该过程需设计四种

引物，其中引物A、D与蛋白a基因的两端完仝配对，引物B、C虽与蛋白a基因中部配对，但在欲引入突变的位

置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。

引物B引物D

5,3，^^5，3,—5*

二,蛋白a基因«

5'—X5f-V—3，'

引物A引物C

5'-----------------------------------3'

[PCR3

5'_______________A_________________3'

3'---------------7-----------------5'

|PCR4

新的蛋白a星因

注：图中“八”为碱基序列变化点。

下列说法不正确的是（）

A.PCRI所用引物应为引物A和B

B.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的产物为模板

C.PCR3无需额外加入引物

D.PCR4的作用是大量扩增突变基因

答案B

解析引物与模板的3'端结合，由图PCR1的产物可知，PCR1所用引物应为引物A和B,A正确；由图可知，

PCR1和PCR2均以原始DNA为模板，PCR3以PCRI和PCR2的产物为模板，PCR4以PCR3的产物为模板，B错

误；由图可知，两条链互为模板和引物，故PCR3无需额外加入引物，C正确；PCR4的作用是大量扩增突变基因，

得到大量的新的蛋白a基因，D正确。

3.利用重叠延伸PCR技术构造融合基因

融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来的方法，其过程如图I所示。图2是

中间载体I和中间载体2（利用融合PCR技术构建成）构建成叶绿体定点整合表达载体示意图（限制酶酶切位点标注于

载体外恻），叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组，将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点

上。请据图回答下列问题：

基因A基因B

引弓I添君3弓显功

第

一

.

阶、融合基因

段|AB

弓型1_引热

图2

(1)图1第一阶段中PCR至少进行次循环，才能获得双链等长的DNA,第二阶段中引物2与引物3部分碱基

的关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。

(2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计种引物，其中能够起

着“搭桥”作用的引物有种。

(3)图2中需使用(填限制陋)和DNA连接睡将两中间载体构建成定点整合表达载体，途中定点整

合表达载体上未标出的结构是O

答案(1)2互补配对(2)86(3)Spe1、SalI复制原点

解析口)分析图1可知，在第一阶段中，利用PCR技术进行第一次扩增(循环)，得到的含有引物2、引物3的产物，

其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA。第二阶段中引物2与引物3

部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。⑵图1显示：通过融合PCR技术，每一次将两个

DNA片段拼接起来，需要4个引物，其中有2个起着“搭桥”作用。依此类推，若通过融合PCR技术将启动子、

标记基因、目的基因、终止子拼接起来，需要设计8种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有6种。(3)图2显

示：启动子和终止子的两端分别有S*I和SRI的识别位点，叶绿体同源重组基因1与2之间也存在S"I和S3

I的识别位点，因此图2中需使用Sp?［、SalI和DNA连接酹将两中间载体构建成定点整合表达载体，图中定点

整合表达载体上未标出的结构是复制原点。

4.利用反向PCR技术扩增未知基因序列

如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以反。RI酶

切为例）。

染色体DNA

二J区偿需

二混合的DNA片段

"「未知序列|已知序列|未知序列二片段F

II连接|DNA连接的

已知序列、

III扩增|ThgDNA聚合酶

।，PCR产物

IV测序、分析［

3,片段F的

完整序列

反向PCR示意图

请据图回答问题：

（1）如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤HI选用的引物必须是（从表格引物①②③④

中选择,填编号）。

名称DNA序列（虚线处省略了部分核甘酸序列）

已知序5'-AACTATGCGCTCATGA-------------GCAATGCGTAGCCTCT-3'

列3'-TTGATACGCGAGTACT-------------CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3z

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3;

引物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

@5r-TCATGAGCGCATAGTT-3/

（2）对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中（虚线处省略了部分核管酸序列），结果正确的是

A.5f-AACTATGCG---------------AGCCCTT-3'

B.5Z-AATTCCATG---------------CTGAATT-3'

C.5Z-GCAATGCGT---------------TCGGGAA-3'

D.5'-TTGyVTACGC---------------CGAGTAC-3,

答案U）②®（2）B

解析由于已知序列的外侧是未知序列（如图中待扩增的未知序列），因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧

的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，

即用限制酶切割DNA,用DNA连接酶将其连接成环，即图中I晦切和I【连接过程。第二步是反向扩增，即根据已

知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用7?qDNA聚合

酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA,即图中III打增过程。本题（1）采用反向PCR扩增未知序列，又因

子链的延伸方向从5'->3Z，可根据已知序列3,-AGTACTCGCGTATCAA-5'和3'-CGTTACGCATCGGAGA-'5,

设计对应PCR弓I初是5'-TCATGAGCGCATAGTT-37和5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3z,本题（2）对产物测序，

得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶&oRI剪切的两端，所以5'端应该是AATTC,对应F片段的开

头，故选B。

5.实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR简称qPCR,灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman

探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被hq

晦切断，在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加I,通过实时检测荧光信号

强度，可得Cl值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列有关叙述正确的是（）

5,-----------------------------3,

注：R表示荧光基因.Q表示淬灭基因。

12(MX)

11000

loom

9(XX)

8(XX)

7(XX)

6000

5(XX)

4(XX)

3000

2(XX)

1(XX)

('»2468101214161^2D2224261K30a2Mi>384()42

循环次数

A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团

B.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核甘酸序列合成1种引物和1种Taqman探针

C.在反应过程中，需要细胞中的ATP为新链的合成提供能量

D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小

答案A

解析DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸

基团，A正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核昔酸序列合成1对引物和1种Taqman探针，B错误：在

反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，C错误；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩

增次数越少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，

D错误,

6.“双脱氧法”基因测序

（2024.海南，15改编）最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核甘三磷酸（ddATP、

ddCTP、ddGTP或ddTTP）,子链延伸时，双脱氧核昔三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：

若配对的为ddATP,延伸终止；若配对的为脱氧腺甘三磷酸（dATP）,继续延伸：PCR产物变性后电泳检测。通过该

方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述不正确的是（）

+ddATP+ddCTP+<ldGTP-HldTTP+<ldATP+<idCTP+ddGTP+ddTTP

ACGTCT

电

二泳

三方

向

对照患者

A.上述PCR反应体系中只加入一种引物

B.电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢

C.5Z-CTACCCGTGAT-3f为对照个体的•段序列

D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G

答案D

解析利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物，A正确：电

泳时，产物的DNA片段越大，形成的阻力越大，迁移速率越慢，B正确；根据题图可知，对照个体PCR子链的测

序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',该序列与对照个体双链DNA分子中模板链的互补链的序列相同，患者为

5'-CTACCTGTGAT-3',对比可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,C正确，D错误。

原理解读（1）双脱氧核甘三磷酸（ddNTP）缺乏PCR延伸所需的3'-OH,因此每当DNA链加入分子ddNTP时，延

伸便终止。（2）每一次DNA测序是由4个独立的PCR反应组成的，4个PCR反应体系均加入模板、引物、dNTP、

DNA聚合酶，唯一不同的是4个反应体系分别加入不同的含有标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。（3）PCR反

应后，在反应体系中就形成了大量起始点相同、终止点不同的DNA片段，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出来，得到

放射性同位素自显影条带，依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。（4）双脱氧法原理示意图：

3，—«—TAGCAACT-------------5'

（o：i—ATCGTTGA

荧先引物

|引物延长和合成阻断

标记1管2管I3管4管

dATPdATPdATPdATP+ddATP

dGTPdGTPdGTP+ddGTPdGTP

dCTPdCTP+ddCTPdCTPdCTP

dTTP+ddTTPdTTPdTTPdTTP

till

-ATCGTddT-ATddC-ATCGTddG-ATCGTTGddA

-ATCGddT-ATCddG-ddA

-AddT|I

产物：按长短排列A

G

泳

电

-ATCGTTGddA后

-ATCGTTddGT3,a

放

射

-ATCGTddTT的

显

影

G自

-ATCGddTC

读

图

-ATCddG直

-ATddCT5f

-AddTA

-ddA

专题强化练

1〜10题每题8分，共80分

1.（2024・盐城高三模拟）PCR引物的3'端有结合模板DNA的关键碱基，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切

点等序列。下列相关叙述错误的是（）

A.图中两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸

B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关

C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物

D.PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充

答案D

解析hgDNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸，

A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC碱基含量越高，

则复性的温度设置越高，B正确；经过5次循环后会产生25=32（个）DNA,其中双镂不等长的DNA有2X5=10（个），

因此扩增5次后可以产生32—10=22（个）目标产物，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过

程中不需要补充，D错误。

2.（2020•北京，12）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因

与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。

左右

边①边

杨树内界界杨树内

源DNA号---------源DNA

动---(“MA3显因J---

②④

注：①（D③④表示引物.

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR犷增时,

应选择的引物组合是（）

A.①+③B.①+②

C.③+②D.③+④

答案B

解析若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3

基因序列，应选择的引物组合是①+②，B符合题意。

3.（2024・盐城高三模拟）关于DNA片段的扩增及电泳鉴定的实验，下列相关叙述错误的是（）

A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸储水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理

B.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，加热到熔化，稍冷却后加入核酸染料混匀

C.电泳鉴定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂可提示终止时刻

D.一20℃储存的小份缓冲液和酶，使用前从冰箱拿出，需要缓慢融化

答案A

解析PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馈水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压

灭菌处理，A错误；电泳整定PCR产物时加样缓冲液中的指示剂澳酚蓝迁移速度较快，可提示电泳的终止时刻，C

正确：PCR所用缓冲液和酹从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，

同样保护酶的活性不被破坏，D正确,

4.（2024•太原高三模拟）为检测乳糖的基因是否导入大肠杆菌，研究人员从受体细胞提取质粒进行PCR扩增，并进

行电泳鉴定，结果观察到的DNA条带不止一条。下列有关叙述错误的是（）

A.DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关

B.出现多条DNA条带可能是扩增时设计的引物过短

C.出现多条DNA条带可能是扩增时模板DNA被污染

D.DNA分子的电泳迁移速率与其大小成正比

答案D

解析DNA分子带正电还是负电与电泳缓冲液的pH有关，电泳缓冲液的pH大于DNA的等电点时，DNA带负电；

电泳缓冲液的pH小于DNA的等电点时，DNA带正电，A正确；扩增时设计的引物过短会导致引物的特异性下降，

致使反应结果中出现大量非特异性结合条带，电泳出现多条DNA条带，B正确；双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的

迁移速率与其大小成反比，较大的分子通过凝胶孔的效率低于较小的分子，因此分子越大，迁移速率越慢，D错误。

5.以DNA复制为基础的双脱氧链终止法是最早的基因测序方法，在反应体系中需加入ddNTP（有ddATP、ddGTP、

ddCTP、ddTTP4种,图1）和dNTP（有dATP、dGTP、dCTP、dTTP4种,图2）。当以3'-CCATGCACT'为模

板测定锥中碱基A的位置时，子链复制延伸到第三位碱基A时，若与其配对的原料是ddTTP,则子链延伸终止；

若与其配对的原料是dTTP,则子链继续延伸；直到第七位的碱基A时，又会出现以上两种配对的可能，这样就能

在一个体系中得出多种长度的子链，再依此类推，可以知道模板链上的其他碱基的位置。图3是以该技术的测序原

理得到某DNA的电泳图谱。下列说法不正确的是（）

ddNTP（双脱银核糖核甘三磷酸）

dNTP（脱氧核糖核甘三磷酸）

图2

泳

方

分

子ddATPddTTPddCTPddGTP

垃

大(=],,

分

子

量

小

图3

A.每个反应体系中应加入相同的模板链、一种ddNTP和四种dNTP

B.ddNTP和dNTP都可脱去两分子磷酸为反应体系提供能量和原料

C.由图3可知复制出的DNA子链的碱基序列是5'—ATCGCATCAT-3Z

D.ddNTP的脱氧核糖3'上脱氧导致其无法连接下一个核甘酸5'上的磷酸基团

答案C

解析双脱氮链终止法是在相同的模板DNA链中分别加入一种ddNTP和四种dNTP的反应体系中进行，由于模板

链相同，复制时DNA子链在进行碱基互补配对到T时，用到了对应的ddATP、dATP,若随机配对上的是ddATP,

则该链复制停止，若随机配对上的是dATP,则复制继续进行，直到下一个对应的碱基T又会重籽出现上述配对的

可能，这样在一个体系中就会因碱基T的配对而出现多条长短不同的DNA链：依此类推，分别可以测出模板链碱

基是A、C、G每个体系下的短链，再进行凝胶电泳分离，最短的链跑得最快，最早合成，而子域的复制是从5'-3'

的方向，所以由图3可以读出子链碱基序列从上到下为3'—ATCGCATCAT-5',总共需要四个体系，分别测出

四个碱基的顺序，A正确，C错误；ddNTP和dNTP同时带有特殊的化学健，且脱去两分子磷酸后可以为DNA复

制提供原料，B正确；由图1和图2可知，ddNTP和dNTP的区别在于五碳糖的3号位是否脱氧，ddNTP3号位为

一H,无法与下一个脱氧核苔酸的磷酸基团连接，D正确。

6.常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。

反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（）

A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列

B.环化阶段，可选用EaMDNA连接附或T4DNA连接酶

C.图中引物，应选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对

D.PCR扩增，将温度调至72℃的忖的是使引物与模板链结合

答案D

解析在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识

别混乱，A正确；T4DNA连接酶或E.e〃DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E.coliDNA

连接酶或T4DNA连接酶，B正确；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对

结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应选择引物I和引物4,且二者间不能互补配对，C正确；PCR

扩增中，将温度调至72C的目的是耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核甘酸根据碱基互补配对原则合成新的DNA

链，D错误。

7.巢式PCR是指先后用外引物和内引物扩增目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，

用外引物（Fl、R1）进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物（F2、R2）

扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是（）

F1一

模板：―

"R1

F2_第一次PCR扩增

中间产物"

第二次PCR扩增

目标产物;^=:

巢式PCRT.作原理示意图

A.两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段

B.第二轮PCR反应能否进行，是对第•轮PCR反应正确性的鉴定

C.由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性

D.如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物

答案D

解析两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板链互补配对，A正确：第二轮PCR使内

引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的婆定，B

正确；由于和两套引物互补的靶序