NYT 4657-2025 动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程标准立项发展报告

动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程StandardizationDevelopmentReport:TechnicalCodeofPracticeforIsolationandIdentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisfromAnimalOrigin摘要动物源伪结核棒状杆菌（*Corynebacteriumpseudotuberculosis*）是一种重要的人兽共患病原菌，可引起小反刍动物的干酪样淋巴结炎及人类的淋巴结炎等疾病，对畜牧业生产安全、动物福利和公共卫生安全构成严重威胁。然而，长期以来我国缺乏统一的动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术标准，导致各检测机构在病原分离方法、鉴定流程和结果判定等方面存在显著差异，检测结果可比性不足，制约了疫病防控工作的规范化和科学化开展。为有效解决上述问题，农业农村部畜牧兽医局组织相关单位制定了农业行业标准NY/T4657-2025《动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程》。该标准于2025年1月9日发布，将于2025年5月1日正式实施。本标准系统规定了动物源伪结核棒状杆菌的实验室检测方法，包括样品的采集与运输、病原分离培养、形态学观察、生化鉴定及分子生物学鉴定等关键技术环节，明确了各步骤的操作要求和结果判定标准，适用于动物组织、分泌物及其他相关样品中伪结核棒状杆菌的分离与鉴定，为动物疫病诊断、流行病学调查和食品安全监测提供了统一的技术依据，填补了我国在该领域标准化建设方面的空白。关键词：伪结核棒状杆菌；分离与鉴定；技术规程；农业行业标准；动物疫病防控；公共卫生安全KeywordsCorynebacteriumpseudotuberculosis;IsolationandIdentification;TechnicalCodeofPractice;AgriculturalIndustryStandard;AnimalDiseasePreventionandControl;PublicHealthSafety一、引言1.1研究背景伪结核棒状杆菌（*Corynebacteriumpseudotuberculosis*）属于放线菌目、棒状杆菌科、棒状杆菌属，是一种革兰氏阳性、兼性厌氧的胞内寄生菌。该菌最早于1888年由Nocard从绵羊的干酪样淋巴结中分离获得，曾被命名为假结核棒状杆菌。伪结核棒状杆菌可感染多种动物，其中以绵羊和山羊最为易感，引起以干酪样淋巴结炎为主要特征的慢性消耗性疾病。该病广泛分布于全球各畜牧业地区，尤其以澳大利亚、新西兰、北美、南美及中东等养羊业发达国家较为严重，给相关国家的养羊业造成了巨大的经济损失。据相关文献报道，部分羊群中该病的临床感染率可高达30%以上，隐性感染率更高，严重影响动物生产性能和养殖经济效益。在我国，随着畜牧业产业结构调整和规模化养殖进程的加快，羊只调运频繁，伪结核棒状杆菌的传播风险日益增加，多个省份相继报道了该病的暴发和流行。同时，该病原菌亦可感染人，特别是与患病动物或污染产品有职业接触的畜牧兽医从业人员、屠宰加工工人等，可引起人淋巴结炎、肺炎甚至败血症等严重疾病，属于人兽共患病原体，对公共卫生安全具有潜在威胁。1.2标准制定必要性目前，我国尚无动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术的国家标准或行业标准。在实际工作中，各检测实验室多参考《中华人民共和国兽药典》或国外相关标准（如OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》）自行制定检测方案，导致各实验室在培养基选择、培养条件、鉴定方法和判定标准等方面存在较大差异，检测结果缺乏可比性。建立统一的技术规程，对于规范检测操作、保障检测质量、提高疫病诊断准确性具有迫切的现实需求。1.3标准制定依据依据《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国农产品质量安全法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》等法律法规，按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，由农业农村部畜牧兽医局提出并归口管理。二、标准编制原则与工作概况2.1编制原则本标准的编制遵循以下原则：（1）科学性原则。标准内容的确定以国内外最新科学研究成果为基础，充分参考OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》中关于伪结核棒状杆菌相关检测技术的规定，结合我国动物疫病检测的实际技术条件和实验室能力水平，确保标准的技术内容科学合理、切实可行。（2）实用性原则。在技术路线设计上，注重方法的可操作性和适用性，兼顾不同层级实验室的技术条件和仪器设备差异，确保市级、县级动物疫病预防控制机构及第三方检测机构能够依据标准顺利开展检测工作。（3）协调性原则。标准的结构格式和编写规则符合GB/T1.1-2020的要求，技术内容与我国现行有效的相关标准保持协调一致。（4）开放性原则。在鉴定方法上兼顾传统生化鉴定和现代分子生物学鉴定两种技术路径，既保证了方法的普适性，又体现了技术进步的发展方向。2.2编制过程本标准编制过程主要包括项目立项、草案起草、征求意见、专家审定和报批发布等阶段。编制组在全面收集国内外相关技术资料和科研成果的基础上，深入调研国内主要动物疫病检测实验室的现有检测方法和技术需求，组织开展验证试验，确定了标准的核心技术指标和方法参数，形成标准草案。随后广泛征求了科研院所、高等院校、各级动物疫病预防控制机构及相关企业的意见，对标准内容进行了多轮修改完善。三、标准主要技术内容3.1适用范围本标准规定了动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定的技术路线、操作程序和结果判定方法，适用于动物组织样品、脓肿分泌物、脓汁、体表拭子等样品中伪结核棒状杆菌的分离与鉴定。标准对实验室生物安全提出了明确要求，所有涉及活菌操作的程序应在符合GB19489《实验室生物安全通用要求》规定的生物安全二级（BSL-2）实验室内进行。3.2样品采集、保存与运输样品的质量直接关系到病原分离的成功率。标准对样品采集、保存与运输作出了详细规定：应在动物生前或死后尽早采集，以无菌操作方式采集脓肿内容物、脓汁或病变组织。采样时应避免杂菌污染，采集的样品应置于无菌容器中密闭保存。样品短期保存（不超过24小时）可在2℃~8℃条件下冷藏运输；若需长期保存，应在-80℃以下冷冻保存。运输时应遵循《病原微生物实验室生物安全管理条例》及GB19489等相关规定，确保样品安全、完整地送达检测实验室。3.3病原分离培养3.3.1培养基选择标准推荐使用血琼脂平板和选择性培养基进行分离培养。血琼脂平板以哥伦比亚琼脂基础添加5%脱纤维绵羊血为佳。液体培养可采用脑心浸出液肉汤（BHI）增菌。3.3.2接种与培养条件将处理后的样品接种于血琼脂平板，在35℃±1℃、含5%~10%CO₂条件下需氧培养24~72小时。该菌生长较为缓慢，初次分离培养常需48小时以上方可观察到明显菌落。3.3.3菌落形态特征在血琼脂平板上，伪结核棒状杆菌菌落为圆形、隆起、边缘整齐，直径1~2mm，呈白色至淡黄色，不透明。多数菌株在绵羊血琼脂平板上呈现狭窄的β溶血环，但部分菌株溶血不明显。培养时间延长（72小时以上），菌落可略微增大，表面趋于干燥。3.4形态学检查挑取可疑菌落进行革兰氏染色和瑞士染色镜检查看菌体形态。伪结核棒状杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体呈多形性——球杆状或短链状，有时可见棍棒状、栅栏状排列或V形排列。无鞭毛、无芽胞。美蓝染色可见菌体两端着色较深的异染颗粒，是与其它棒状杆菌鉴别的重要特征之一。3.5生化鉴定标准规定的生化鉴定项目主要包括：触酶试验（阳性）、氧化酶试验（阴性）、尿素酶试验（阳性）、硝酸盐还原试验（可变，多数为阴性）、葡萄糖发酵试验（阳性）、蔗糖发酵试验（阴性）、甘露醇发酵试验（阴性）、七叶苷水解试验（阴性）。其中，尿素酶阳性和硝酸盐还原阴性是鉴别伪结核棒状杆菌与相关种的重要生化特征。3.6分子生物学鉴定标准推荐采用PCR方法对分离菌株进行分子生物学确认。针对伪结核棒状杆菌磷脂酶D（PLD）基因设计的特异性引物进行PCR扩增，可特异性检出该菌。标准同时规定了PCR反应体系和反应条件、电泳检测方法及结果判定标准。此外，标准允许采用16SrRNA基因测序或全基因组测序等更为精确的方法进行鉴定，测序结果经与GenBank等数据库比对分析后确定种属。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR、数字PCR等技术也被逐步应用于该菌的快速检测。3.7结果判定与报告标准规定了明确的判定标准：-阳性判定：分离菌株在形态学、培养特性、生化特性方面均符合伪结核棒状杆菌特征，且PCR检测结果为阳性。-疑似判定：培养特性和形态特征符合要求，但生化鉴定结果不完全一致，且PCR未进行或结果不明确。-阴性判定：经增菌培养和直接分离培养均未分离到可疑菌落，或分离菌株经鉴定不符合该菌特征。标准要求检测报告应包含样品信息、检测方法、检测结果及结论等内容，确保检测信息完整可追溯。四、主要起草单位本标准主要由全国动物卫生标准化技术委员会组织实施，中国动物卫生与流行病学中心牵头起草。中国动物卫生与流行病学中心是农业农村部直属的正局级事业单位，承担全国重大动物疫病流行病学调查、诊断、监测和防控技术研究等重要职能。中心设有国家外来动物疫病诊断中心、国家动物血清学制品质量检测中心等国家级技术平台，建有生物安全三级实验室，拥有一支高素质的专业技术人才队伍，在动物疫病病原学、血清学、分子生物学诊断技术研究方面具有深厚的技术积淀和丰富的实践经验，先后主持或参与制修订多项国家和行业标准。此外，中国兽医药品监察所、中国农业大学动物医学院、部分省级动物疫病预防控制中心等单位也参与了本标准的协作验证和技术咨询工作。各参与单位密切合作，为标准技术内容的科学性、合理性和可操作性提供了有力保障。五、标准实施意义NY/T4657-2025《动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程》的发布和实施，具有以下重要意义：（1）填补标准空白，完善标准体系。该标准填补了我国在动物源伪结核棒状杆菌检测领域标准化建设的空白，丰富了我国动物疫病诊断技术标准体系，为相关检测工作提供了权威的技术依据。（2）规范检测行为，提升检测质量。标准的实施将有效统一全国各级实验室的检测方法和判定标准，减少因方法差异导致的检测结果误差，提高检测结果的准确性和可比性，为动物疫病诊断和疫情评估提供可靠的技术支撑。（3）强化疫病防控，保障产业安全。为伪结核棒状杆菌病的流行病学调查、疫情监测和净化消灭提供标准化检测手段，有助于及时发现和掌握疫情动态，科学指导防控措施的实施，降低该病对养羊业等畜牧产业的经济损失。（4）保障食品安全，维护公共卫生。为肉类及肉制品的食品安全监测提供技术手段，有助于切断病原菌通过动物源性食品传播给人的途径，降低职业暴露人群的感染风险，为人兽共患病防控和公共卫生安全保障提供技术支持。（5）促进国际贸易。统一的检测标准有助于我国动物产品的卫生质量和安全水平与国际接轨，减少因检测方法差异引发的贸易争端，便利国际进出口贸易的开展。六、结论与展望NY/T4657-2025《动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程》的制定与实施，是我国动物疫病诊断标准化建设的一项重要成果。该标准立足我国动物疫病防控实际需求，充分吸收国际先进技术经验，科学规定了动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定的技术流程和操作要求，具有科学性、先进性和实用性。标准的发布填补了该领域行业标准的空白，为各级动物疫病预防控制机构、检验检疫机构、科研院所及相关企业提供了统一、规范的技术依据。展望未来，随着畜牧业的持续发展和公共卫生安全要求的不断提高，动物疫病诊断标准化工作将面临更高的要求和新的挑战。建议在标准实施过程中，持续跟踪标准应用效果，及时收集实施反馈信息，结合病原菌变异动态和新型检测技术发展情况，适时开展标准的修订完善工作。同时，应加大标准宣贯培训力度，确保标准在各级实验室得到有效实施。随着分子诊断技术、基因组学技术和人工智能技术的快速发展，未来该标准还可逐步纳入实时荧光定量PCR、重组酶聚合酶扩增（RPA）等新型快速检测方法，以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）等新兴鉴定技术，持续保持标准的技术先进性和适用性，为保障我国畜牧业健康发展和公共卫生安全提供更加有力的技术支撑。参考文献[1]全国动物卫生标准化技术委员会.动物源伪结核棒状杆菌分离与鉴定技术规程:NY/T4657-2025[S].北京:中国农业出版社,2025.[2]世界动物卫生组织（OIE）.陆生动物诊断试验与疫苗手册（第29版）[M].巴黎:OIE,2021.[3]中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国动物防疫法[S].2021.[4]全国认证认可标准化技术委员会.实验室生物安全通用要求:GB19489-2008[S].北京:中国标准出版社,2008.[5]全国标准化原理与方法标准化技术委员会.标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则:GB/T1.1-2020[S].北京:中国标准出版社,2020.[6]BairdGJ,FontaineMC.*Corynebacteriumpseudotuberculosis*anditsroleinovinecaseouslymphadenitis[J].JournalofComparativePat