GBT 43776-2024 单细胞测序样本采集与处理规范标准立项发展报告

单细胞测序样本采集与处理规范StandardizationDevelopmentReport:SpecificationforCollectionandProcessingofSingle-CellSequencingSamples摘要关键词：单细胞测序；样本采集；样本处理；质量控制；国家标准；标准化Keywords:Single-cellsequencing;Samplecollection;Sampleprocessing;Qualitycontrol;Nationalstandard;Standardization1引言1.1研究背景单细胞测序技术自2009年首次报道以来，经历了从单细胞转录组测序到单细胞多组学测序的快速发展历程。该技术通过将组织解离为单细胞悬液，或通过单细胞核分离、空间条形码标记等手段，实现对数以万计甚至百万级单细胞的并行测序分析，从而揭示组织内的细胞异质性、稀有细胞类型及其功能状态。近年来，单细胞测序已被广泛应用于人类细胞图谱构建、肿瘤微环境解析、免疫治疗疗效预测、神经退行性疾病机制探索、发育谱系追踪等众多研究方向，并在辅助生殖、液体活检、药物研发等临床转化场景中展现出巨大潜力。然而，单细胞测序的全流程涉及样本采集、运输、保存、组织解离、单细胞悬液制备、建库测序及生物信息学分析等多个环节，其中前端的样本采集与处理环节对最终数据质量有着决定性影响。研究已表明，组织离体后的缺血时间、解离温度与时长、酶消化条件、细胞活率及双细胞率等因素均会显著影响单细胞转录组的表达谱，造成技术性批次效应甚至生物学假象。由于缺乏统一的国家级技术标准，不同实验室、不同平台间在样本处理方法上的差异导致数据可比性差、可重复性低，严重制约了多中心队列研究和临床转化应用的推进。1.2标准编制必要性目前，国际范围内尚缺乏专门针对单细胞测序样本采集与处理的通用技术标准。现有的相关指南多以学术共识或行业白皮书形式存在，如国际人类细胞图谱计划（HumanCellAtlas,HCA）发布的技术建议等，但其权威性和普适性有限。我国在单细胞测序领域的研究产出已位居国际前列，然而在标准化建设方面仍显滞后。GB/T43776-2024《单细胞测序样本采集与处理规范》作为我国在该领域的首个国家标准，填补了这一空白，为单细胞测序技术的规范应用提供了权威性技术依据。2标准概况与适用范围2.1标准基本信息GB/T43776-2024《单细胞测序样本采集与处理规范》由国家标准计划批准发布，发布日期为2024年3月15日，并于同日正式实施。该标准归口于全国生物样本标准化技术委员会，采用中文编写，分类号归属生物学、植物学、动物学类别。该标准的发布层级为国家标准，具有在全国范围内统一执行的效力，适用于科研机构、医疗机构、第三方检测机构以及生物技术企业等开展单细胞测序相关工作的各类主体。2.2适用范围与边界该标准确立的适用范围涵盖了单细胞测序全流程中的样本采集与处理两大阶段，具体包括样本类型界定、采集操作要求、样本运输与保存条件、组织解离技术规范、单细胞悬液质量评价以及相关数据处理要求。值得注意的是，该标准对不同来源的样本类型进行了分类指导，明确了组织样本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织）、液体样本（外周血、骨髓、脑脊液、尿液等）以及培养细胞样本的处理路径。同时，标准也明确了其不适用于单细胞测序后续的文库构建、测序平台操作和生物信息学分析环节，这些部分属于其他相关标准的规范范畴。3标准核心内容解析3.1样本采集要求标准对单细胞测序样本的采集环节提出了系统性技术要求。在采集前准备阶段，标准明确了样本采集方案的设计原则，包括样本量估算依据、生物学重复设置建议以及伦理审查要求。在采集操作方面，标准对不同组织类型分别规定了取材部位、取材大小和样本完整性的最低要求。对于新鲜组织样本，标准特别强调了离体缺血时间（冷缺血时间/热缺血时间）的控制上限，要求从组织离体到开始处理的时间间隔应在规定范围内，以避免RNA降解和细胞应激反应对后续测序数据造成的干扰。针对液体样本，标准规定了外周血样本采集所需使用的抗凝剂类型及浓度（如EDTA或肝素锂）、采血量范围和运输温度要求，并明确了去除红细胞和血小板等前处理步骤的技术参数。对于单细胞悬液制备环节，标准要求最终获得合格单细胞悬液的细胞活率不低于规定阈值（通常不低于85%），并控制双细胞率、碎片率在可接受的范围内。3.2样本运输与保存条件样本的运输与保存是保障单细胞测序数据质量的关键环节，也是实际工作中最易出现操作偏差的部分。GB/T43776-2024针对不同样本类型提出了差异化要求：-新鲜组织样本：优先推荐在采集后1小时内进行组织解离处理。若需短途运输，应在2~8℃低温条件下保存，运输时间不宜超过4小时；若运输时间在4~24小时之间，须采用专用组织保存液（如HypoThermosol®等），并维持2~8℃冷链运输。对于超过24小时的运输场景，标准建议考虑采用冻存方案或细胞核提取方案。-冰冻组织样本：要求采集后迅速在液氮中速冻，或使用异戊烷-干冰浴进行速冻处理，随后转移至-80℃冰箱或液氮罐中长期保存。标准对冷冻组织的切片厚度、解冻方式和解离方案也给出了指导建议。-液体样本（外周血）：对于外周血单个核细胞（PBMC）分离，标准要求采血后4小时内完成密度梯度离心分离，分离后的PBMC可短期保存于2~8℃（不超过24小时），或经冻存液重悬后程序降温至-80℃或液氮中长期保存。-培养细胞样本：要求细胞处于对数生长期且汇合度不超过80%~90%为宜，消化处理需控制胰酶浓度和处理时间，以避免过度消化导致细胞膜表面蛋白损失或细胞应激。3.3组织解离与单细胞悬液制备组织解离是单细胞测序样本处理流程中技术难度最大、对数据质量影响最直接的环节。GB/T43776-2024从解离方法选择、酶体系配比、解离时间和温度控制、细胞纯化等方面给出了详细规范：在方法选择上，标准推荐根据组织类型和细胞外基质成分优先选择酶解离法（如胶原酶、分散酶、透明质酸酶等组合）、机械解离法或二者联合方案。对于富含结缔组织的样本（如肿瘤组织、纤维化组织），建议采用酶解离与机械解离结合的方法，并辅以温和的反复吹打以促进细胞释放。标准特别关注了解离过程对细胞状态的影响，要求解离全程在4℃或冰上操作，或采用37℃短时消化方案（控制在15~30分钟内），以减少酶解过程中的基因表达变化。解离完成后，须通过细胞筛网（通常为40~70μm孔径）过滤去除细胞团块和碎片，并采用红细胞裂解液处理以去除红细胞污染。3.4质量控制指标质量控制是GB/T43776-2024的核心内容之一。标准建立了涵盖细胞活力、细胞数量、细胞聚集率、RNA完整性、免疫表型稳定性等维度的多层次质量控制指标体系：-细胞活力（Viability）：推荐采用台盼蓝排斥法或荧光染料法（如AO/PI双染）进行检测，合格样本的细胞活率应不低于85%。-细胞总数与浓度：要求根据下游建库方案确定最低细胞投入量，推荐使用自动化细胞计数仪进行精确计数。-双细胞率/聚集率：应控制在10%以下，超过该阈值建议重新解离或增加过滤步骤。-RNA完整性：对于转录组测序样本，标准建议利用RNA完整性指数（RIN值）或RNA完整性与浓度值（DV200）评估总RNA质量。-样本纯度：排除非靶细胞（如红细胞、死细胞碎片、上皮细胞角蛋白碎片等）污染的影响。此外，标准还要求对样本处理的全程进行信息记录，包括样本来源信息、采集时间、处理操作记录、质量检测结果等，以保证样本处理的可追溯性和数据可靠性。3.5数据处理与信息记录要求GB/T43776-2024对与样本采集与处理相关的数据和信息记录也提出了技术要求。标准要求相关操作记录应包含样本唯一标识编码、采集地点与时间、操作人员信息、设备信息、试剂批次（包括酶批号、培养基批号等）、质量检测结果及判定结论等要素。该要求与国际生物样本库领域的“样本溯源”理念（如BSEN15725、ISO20387等标准框架）保持一致，为中国单细胞测序数据实现跨中心共享与整合提供了基础条件。4参与起草单位与标准化组织介绍GB/T43776-2024《单细胞测序样本采集与处理规范》的编制工作汇聚了国内单细胞测序领域和生物样本标准化领域的优势力量，由多家权威科研机构、医疗机构和企业联合参与起草。主要起草单位包括中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）、复旦大学附属中山医院、深圳华大生命科学研究院、博奥生物集团有限公司、北京贝瑞和康生物技术有限公司等单位。以下重点介绍中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）在本标准编制中的核心作用：中国科学院北京基因组研究所（以下简称“基因组所”）成立于2003年，是中国科学院在基因组学领域布局的核心研究机构，2019年加挂“国家生物信息中心”牌子，承担国家生物信息基础设施建设和生命科学大数据汇交管理的重要职能。基因组所长期从事基因组学与生物信息学前沿研究，在单细胞测序技术开发、算法研发及示范应用方面积累了深厚的基础。在GB/T43776-2024的编制过程中，基因组所作为主要起草单位，承担了标准框架设计、核心技术指标起草和意见汇总处理等关键任务。基因组所依托其在国家生物信息中心运行中积累的海量样本管理实践经验，以及承担国家重点研发计划“单细胞测序技术研发与临床转化”等重大项目的研究成果，为标准中样本采集流程规范化、质量控制指标体系建立和数据溯源管理要求等条款的制定提供了重要的科学数据支撑和行业实践经验。此外，基因组所还牵头建立了国内首个单细胞测序数据汇交与共享平台，推动建立了单细胞转录组、表观组等多层级数据的统一存储与标准化处理流程。这些基础性工作为GB/T43776-2024中样本信息记录、数据处理与质量评价等内容的确定提供了直接的技术参考，也为标准发布后在科研和临床场景中的落地实施积累了实践经验。5标准实施意义与应用前景5.1对科研领域的规范作用GB/T43776-2024的发布与实施，对我国单细胞测序领域的科研活动将产生深远影响。该标准通过为样本采集与处理提供统一的技术要求，有效地降低了不同实验室、不同操作人员之间的技术差异，从而大幅提升了单细胞测序数据的可比性和可重复性。尤其对于大规模国际合作项目（如人类细胞图谱计划、肿瘤微环境图谱计划等）而言，统一的前端样本处理标准是多中心数据整合的前提条件。标准中关于质量控制最低阈值的规定，为科研人员在实验设计阶段和数据分析阶段提供了明确的技术参考。研究者可依据标准中的质量评价指标对数据进行前评估，识别并剔除不合格样本，从而提高测序数据质量和后续分析的可靠性。此外，标准要求的信息记录规范也为科研论文的方法学描述和原始数据归档提供了规范化指引，有助于提升我国生命科学研究的整体可重复性水平。5.2对临床转化应用的推动作用单细胞测序技术正在加速向临床应用转化，涉及无创产前检测、肿瘤微小残留病灶监测、免疫治疗疗效预测、辅助生殖胚胎优选等方向。然而，临床样本的采集条件较科研场景更为复杂，面临样本来源多样、采集时间不可控、运输距离远、保存条件受限等现实问题。GB/T43776-2024对临床相关样本类型（如外周血、骨髓、胸腹水、穿刺组织等）的采集与处理提出了明确的操作要求和质量控制标准，为医疗机构开展单细胞测序临床检测项目提供了标准化操作依据。该标准有助于推动单细胞测序技术从“科研工具”向“临床检测手段”转化。通过规范样本前端处理流程，可有效保证临床样本的检测成功率、数据稳定性和结果可重复性，进而为单细胞测序相关体外诊断试剂盒的研发注册、实验室自建检测方法的性能验证以及第三方医学检验实验室的质量管理等提供标准化参照。5.3对产业发展的引领效应在产业化层面，GB/T43776-2024为单细胞测序上游试剂耗材企业（如组织保存液、酶解试剂盒、单细胞制备系统等）提供了产品研发和质量控制的技术参照。标准的实施将促使相关企业按照统一的技术要求进行产品性能验证和一致性评价，推动国产试剂和设备的质量升级。同时，该标准的出台也为第三方医学检验实验室和生物样本库开展单细胞测序样本处理服务提供了市场准入的质量基准。随着标准的逐步推广和认证认可体系的建立，有望形成涵盖样本采集、保存、运输、处理到质控的全链条标准化服务体系，推动我国单细胞测序产业朝规范化方向有序发展。6结论与展望GB/T43776-2024《单细胞测序样本采集与处理规范》是我国单细胞测序领域首个获批发布的国家标准，具有里程碑式的意义。该标准的发布填补了长期以来单细胞测序样本前端处理环节缺乏统一技术规范的空白，为科研机构、医疗机构和产业主体开展单细胞测序相关工作提供了系统化、可操作的技术依据。从标准的内容架构来看，GB/T43776-2024涵盖了样本采集、运输、保存、组织解离、单细胞悬液制备、质量控制和信息记录等全流程关键环节，构建了一套完整的技术规范体系。该标准在科学性、实用性和前瞻性方面均达到了较高水平，既充分吸收了当前国际学术界在单细胞测序样本处理方面的最佳实践和技术共识，又兼顾了我国科研和临床场景的实际需求，具有较强的可操作性。展望未来，随着单细胞测序技术的不断演进，如空间转录组测序、单细胞多组学联合分析、单细胞表观遗传测序等新技术的成熟和推广，对样本采集与处理也必将提出更高的技术要求