植物细胞培养课件

植物细胞培养

什么是植物细胞培养？

植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。几个重要概念（一）：（1）全能细胞：能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。（2）愈伤组织：由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。愈伤组织细胞是分化的，但还没形成组织上的结构。愈伤组织可以用继代培养的方式长期保存，也可以通过悬浮培养而迅速增殖，也可以用作原生质体培养时原生质体的来源。（3）外植体：指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。（4）继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。几个重要概念（二）：11.1植物细胞培养的意义★植物细胞含有人类所需的成分，以前采用传统方法提取分离这些物质，但是由于如今资源短缺和需求量的不断加大，靠提取分离途径已很难满足人类的需求。目前利用植物细胞培养技术生产植物产品已成为工业化生产植物产品的一条有效途径。★有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些产物。例如：作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。

与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点包括：（1）代谢产物的生产是在控制条件下进行的，因此可以通过选择优良细胞系和优化培养条件等方法得到超越整株植物产量的代谢产物。不仅节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域的限制。（2）细胞培养是在无菌条件下进行的，因此可以排除病菌和害虫的影响。（3）可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分（4）可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。总之，利用植物细胞培养进行有用物质生产不受时间、环境等条件限制，而且快速、高效。11.2植物细胞培养发展史●起源于上世纪初，20世纪30年代以来，该领域取得了许多大的进展；是在植物组织技术基础上发展起来的●1902年，Haberlandt（植物组织培养的先驱，被誉为“植物组织培养之父”）提出了植物细胞全能性的假说，成为植物细胞培养的依据。并首次尝试分离植物并进行培养，但由于条件等限制没能成功。●1939年，Gautheret和Nobercourt分别成功地培养了烟草、萝卜、杨等形成层组织。至此，植物组织培养才真正开始。●50年代，Taleche和Nickell确立了植物细胞能够成功地生长于悬浮培养物中。●

1956年，Nickell和Routin首次申请用植物组织培养细胞生产化学物质的专利。从此以后，植物组织和细胞培养进入实质应用研究开发阶段。●至今植物细胞培养已着手研究的植物多达100余种，进入中试开发或工业生产规模的有人参、紫草、红豆杉、毛地黄、烟草等。●当前植物细胞培养的应用领域主要涉及以下三个方面：（1）有用代谢物质的生产；（2）珍贵植物和名贵花卉等种苗的快速繁殖；（3）进行植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究。11.3植物细胞培养基

与动物细胞培养相比，植物细胞培养最大优点是植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。11.3.1植物细胞培养基的组成无机盐碳源维生素生长调节素有机添加剂等★无机盐类：提供植物细胞生长所需的“大量元素”和“微量元素”，25mmol/l左右硝酸盐可单独作为植物细胞培养的无机氮源，但实际应用中，加入一些铵盐对细胞的生长是有利的。培养基中必须添加钾元素微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等★碳源和能源：蔗糖和葡萄糖通常在培养基中增加蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。★维生素：植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。★植物生长激素：包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。植物生长素具有促进细胞分裂的作用，并可促使根的形成和生长；细胞激动素对芽的诱导具有重要作用；赤霉素通常用于原生细胞形成后的植株再生。★有机氮源：蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。有机氮源对细胞初级培养的早期生长阶段有利。加入L-谷氨酰胺(2~8mmol/l)或其他氨基酸混合物对植物细胞的培养很有好处。★有机酸：加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羧酸循环的中间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。此外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。★复合物质：酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可作为细胞的生长剂。

目前，应用最广的基础培养基主要有MS(Murashige和Skoog)、B5（Gamborg等）、E1以及N6培养基（Philips和Collins）。11.3.2植物细胞培养基的制备无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生长激素：采用最高纯度级，有些生长激素需重结晶提纯。水：严格采用蒸馏水或高纯度的去离子水pH：应用0.5mol/l的HCl或0.2mol/l的NaOH进行调节灭菌：121℃，20min

对于热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，应采用过滤法灭菌母液：配制成使用浓度的10或100倍的母液，10℃以下保存待用。一般含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。单独配制保存：CaCl2、KI、EDTA的钠或亚铁盐单独配制保存，使用时再稀释混合。11.4植物细胞培养方法单倍体细胞培养原生质体培养固体培养液体培养悬浮培养固定化培养■单倍体细胞培养：用花药在人工培养基上进行培养■原生质体培养：植物的体细胞经过纤维素酶处进后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最终可长成植株。■固体培养：凝固剂几乎都使用琼脂，6~10%■液体培养：分为静止培养和振荡培养两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的培养；振荡培养需要摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交换。■悬浮培养：一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的。■固定化培养：应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。11.5植物细胞的大规模培养技术植物细胞的大规模悬浮培养植物细胞或原生质体的固定化培养11.5.1植物细胞的大规模悬浮培养★在应用上多采用连续培养方式，进行某些植物有效成分的工业化生产；★通常采用水平振荡，可变速率为30~150r/min，振幅2~4cm，温度24~30℃★寻找适合于悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散和保持分化再生能力的培养基（1）悬浮培养中的植物细胞的特性●与微生物细胞相比，植物细胞要大得多，直径一般约为10~200μm，平均直径比微生物细胞大30~100倍。●植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，而通常以细胞数在2~200之间，直径为2mm左右的非均相集合细胞团的方式存在。当细胞浓度高、粘度大时容易产生混合和循环不良等问题。●植物细胞的纤维素细胞壁很容易被剪切力高的传统搅拌式微生物反应器损伤。●与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般需要2~3周，半连续或连续培养时间一般长达2~3个月。同时植物细胞培养基成分丰富而复杂，很适合真菌等生长。因此，对于植物细胞培养，保持无菌有一定难度但是相当重要。（2）植物细胞培养液的流变特性★由于植物细胞常常趋于成团，且不少细胞在培养过程中易产生粘多糖等物质，使传氧速率降低，影响了细胞的生长。★培养过程中培养液的粘度（描述培养液的流变学特征）变化可由细胞本身和细胞分泌物等引起。★在相同的物质浓度下，大细胞团的培养液的表观粘度明显大于小细胞团的培养液的表观粘度。（3）植物细胞培养过程中的气体传递与影响●氧的影响所有的植物都是好气性的，需要连续不断地供氧，并要严格控制溶解氧的水平。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成和细胞浓度等相关。通常用体积氧传递系数（KLa）来表示氧的传递情况。●CO2的影响：对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时，CO2和氧气浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培养有时需要通入一定量的CO2气体。（4）泡沫和表面粘附性●植物细胞培养过程中产生的气泡更大，而且会覆盖有蛋白质或粘多糖，因此粘度也更大，细胞极易被包埋在泡沫里，从循环的营养液中带出来，造成非均相培养。可以采用微生物培养过程消泡的一些方法对泡沫进行消除，否则也会对混合和培养的稳定性产生影响。●细胞常会粘附于培养容器或反应器内一些挡板、反应器部件、电极等表面。可采用在表面涂以硅油等消除或降低粘附现象。（5）悬浮细胞的生长与繁殖悬浮培养的优点：☆增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；☆可带走培养物产生的有害代谢产物；★保证氧的充分供给

一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。（6）细胞分裂和愈伤组织的形成●悬浮培养的单个细胞在3~5天内就可以观察到细胞分裂。●经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。※如果培养的目的是为了快速繁殖经济型植物种苗，大约两周后就可以将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，一般三周后可分化出试管苗；※如果是以生产代谢产物为目的的大规模细胞培养，则应采取适当手段分散开不断聚集的细胞团，使细胞保持继续增殖。11.5.2植物细胞或原生质体的固定化培养机械稳定性较高产率较高更长的稳定期（即生产期）（1）海藻酸盐固定化凝胶的稳定性随着聚合物浓度的增加而增加；一般需综合考虑稳定性和可操作性。（2）卡拉胶固定化卡拉胶溶液必须加热，以便保持液态滴入法：滴入含KCl的培养基中模铸法两相法：搅拌，豆油（3）琼脂糖固定化（不需要其它离子来保持胶的稳定性）凝块法、模铸法、两相法11.5.3植物细胞培养方式间歇培养：还有流加间歇培养，两级或多级间歇培养等连续培养：单级（生长偶联型产物的生产）、多级（非生长偶联型次级代谢物的生产）和回流式等多种形式固定化细胞培养：提高生产能力、保护细胞、换液方便、能除去有毒或抑制性代谢物等11.6影响植物细胞培养的因素细胞本身的特性环境因素11.6.1细胞的遗传特性从理论上讲，所有植物细胞都具有构成一个完整植物的全部遗传信息，因此可以推断，单个细胞也具有产生其亲本植株所能产生的次生代谢物的遗传基础与生理功能。但是，由于取材部位限制决定了所培养对象并不能象完整植株的某一部位一样高效合成所需的目的产物。因此，在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物是必须弄清楚产物的合成部位。11.6.2培养的环境条件温度：25℃左右pH值：5~6，培养过程中需不断调节培养液的pH值营养成分：一方面要满足植物细胞的生物量的增长，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。一般地，增加氮、磷和钾的含量会加快细胞生长，增加蔗糖含量可增