植物细胞制药课件

植物细胞工程制药第一节概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近300种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴趣的成分。一、基本概念1、植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。植物无菌培养技术分如下几类：①幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（plantculture）；②从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做“愈伤组织培养”（callusculture）；③能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为“悬浮培养”（suspensionculture）；④离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为“器官培养”（organculture）；⑤未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培养”（embryoculture）。1、植物组织和细胞培养

2、悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。3、细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。4、分生组织培养分生组织培养（meristemculture）又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括1~2个叶原基。5、外植体外植体（explant）是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。6、器官形成器官形成（organogenesis）一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成（embryogenesis）。当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体”（embryoid，orembryo-like）或“不定胚”（adventitiousembryo）。7、无性繁殖系无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”（clonalvariant）。8、突变体细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为突变体（mutant）。由单细胞形成的无性系称为“单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单细胞变异体”。9、继代培养由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”。连续多代的培养即为“继代培养”（subculture），又称“连续培养”。但习惯上“连续培养”一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。10、次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：①有明显的分类学区域界限；②其合成需在一定的条件下才能发生；③缺乏明确的生理功能；④是生命的多余成分。现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。二、植物细胞培养的发展简史19世纪上半页，Schleiden和Schwann提出了细胞学说；20世纪初，德国著名植物学家Haberlandt依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；20世纪20年代初至30年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。Hanning首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。第二节植物细胞的形态和生理特性一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。二、植物细胞的结构特征三、细胞后含物和生理活性物质1、细胞后含物（1）生物碱一类含氮的有机化合物，广布于植物界。茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。中草药中含有多种生物碱，如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。（2）糖苷类指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。洋地黄毒苷有强心作用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。（3）挥发油

是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油等。（4）有机酸

糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。2、生理活性物质生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。（1）酶类酶（enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。（2）维生素维生素（vitamin）是一类复杂的有机物，常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素B12处理后可促进不定根的生长。（3）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，其量虽微，但作用甚大。（4）抗生素和植物杀菌素抗生素（antibiotic）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（plantfungicidin）。四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。延迟期（lagphase）细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和培养基性质，其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高RNA含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分。加速期（accelerationphase）细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA浓度和蛋白质累积率，持续时间3~4代，其特征为干重常数，细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力增加细胞鲜种、干重及RNA酶活性减少。对数期（logphase）介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间，其特征为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少稳定期（stationaryphase）细胞数稳定，其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。细胞团产生的原因有两个：（1）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（2）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质。植物细胞其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱。培养过程中供氧。第三节植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备二、培养基及其组成三、培养方法一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。常用灭菌剂的效果比较灭菌剂使用浓度/%去除难易程度灭菌时间/min效果次氯酸钙次氯酸钠过氧化氢溴水硝酸银氯化汞抗生素9~100.5~53~121~210.1~14~50mg/L易易最易易较难较难中5~305~305~152~105~302~1030~60很好很好好很好好最好较好许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤组织（器官）灭菌步骤备注灭菌前处理灭菌灭菌后处理种子果实茎切段储藏器官叶片纯酒精中浸10min，再用无菌水漂洗纯酒精漂洗自来水洗净，再用酒精洗自来水自来水，吸干，纯酒精100g/L次氯酸钙浸20~30min，再用10g/L溴水浸5min20g/L次氯酸钠浸10min20g/L次氯酸钠浸5~30min20g/L次氯酸钠浸20~30min1g/L氯化汞浸1min无菌水洗3次，在无菌水中发芽；或无菌水洗5次，在湿无菌纸上发芽无菌水冲洗，再剖除内部组织的种子无菌水洗3次无菌水洗3次，滤纸吸干无菌水反复冲洗，滤纸吸干用幼根或幼芽发生愈伤组织获得无菌苗选取嫩叶、叶片平放在琼脂上灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会也多。定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯的块茎等。二、培养基及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。三、培养方法植物细胞培养，按培养对象来说，可分为原生质体培养和单倍体细胞培养；按照培养基类型分为固体培养和液体培养。固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。固体培养的特点是简便易行、所占空间小。但也有缺点，主要是不均衡现象。固体培养和液体培养互相配合是组织（细胞）培养的常规操作。温度是培养中重要的因素，一般控制在251℃之间。有些植物材料在诱导愈伤组织时需要在黑暗条件下进行，但诱导愈伤组织的器官分化和其他材料的培养都需要光照。光照以每天16h为宜。外植体在培养三周左右必须转换至新鲜培养基上，以保持正常生长。植物组织的培养（视频）组织培养与观察液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。1、成批培养法将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，人们基于此原理设计了植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。2、半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。3、连续培养法利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。4、固定化培养法固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型。细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间的物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制条件。第四节影响植物次级代谢产物累积的因素①生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（O2）、pH和渗透压等；③化学条件：无机盐（N、P、K等）、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等；④工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。一、外植体选择不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积，有的次级代谢产物累积是在延迟期进行，有的则在加速期累积，当然也有的累积时间与细胞生长曲线同步，还有的则在稳定期大量累积次级代谢产物。二、培养条件的影响1、培养环境的内在因素（1）接种和诱导：外植体的大小（2）基本培养基组成：愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。（3）碳源：碳源通常以光自养培养中的CO2或异养培养中的糖类两种形式提供，其性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响次级代谢产物糖类乳糖（6%）蔗糖（3%）甘露糖醇（0.3~0.6mol/L）长春花碱/mg•L-1蛇根碱/mg•L-1游离氨基酸/mol•L-150————16.601.400.55——21.502.86（4）植物生长调节剂植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。如Furuya在培养烟草细胞时发现，加入IAA时培养物中有尼古丁生成，但2，4-D存在时则不合成该化合物。说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。（5）O2和pH①O2

：悬浮细胞培养和固定化细胞培养前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为120~160r/min，过快易导致细胞破裂；后者仅能采用通气方式，一般使用含5%CO2的洁净空气。②pH：5~6之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，在培养过程中培养液的pH变化较小。（6）渗出物（exudates）：如落花生悬浮培养细胞培养的后期培养液中含有27种多肽成分。此外，培养细胞分泌产物的量也取决于培养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，酶的分泌量就达到了稳定期的水平，尔后酶活性随乙醇量的增加而降低。次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。2、两步培养法第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（growthmedium）。第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。如：长春花培养3、培养环境的外部因素（1）温度培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为20~28℃。在一定温度（≤15℃

）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。（2）搅拌频率植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关，具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上。（3）培养容器的影响植物培养细胞次级代谢产物的产生可因为所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而得到不同的结果。（4）光的影响光照时间、光质和光强对次生代谢产物（如黄酮、黄酮醇、花色素苷、挥发油等）的累积都有一定影响。第五节植物细胞培养的生物反应器植物细胞的直径为10

m~100m，比细菌和真菌细胞大10~100倍；植物细胞的纤维素壁具有较差的抗剪切能力；植物细胞的呼吸率低，对氧的需求也低。此外，植物细胞培养生物反应器的设计与各类植物细胞的不同生理特征和代谢方式有关，同时也与培养方式相联系。反应器的选择取决于生产细胞的密度、通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分为以下几类：①摇瓶②搅拌型生物反应器③环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器。目前主要用于植物细胞大规模培养的生物反应器有一、机械搅拌式生物反应器二、鼓泡塔生物反应器三、气升式生物反应器四、转鼓式生物反应器五、固定化细胞生物反应器第六节进展与展望一、诱导子在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。诱导子的作用随诱导子种类的不同而异，如在紫杉醇的细胞工程研究中，Christen等向培养基中加入高压灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或加入硫酸矾和3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。诱导子有两种：生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子（conidia），降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物等成分。非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。生物诱导子和非生物诱导子在其量效关系上也有区别。二、前体饲喂前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。生物合成研究结果表明，次级代谢物的形成，依赖于3种主要原材料（结构范围，buildingblock）的供应，即：①莽草酸：属芳香化合物，是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；②氨基酸