ISO 21474-22022 体外诊断医疗器械.核酸的多重分子试验.第2部分验证和验证标准立项发展报告

体外诊断医疗器械核酸的多重分子试验第2部分：验证和验证标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:InVitroDiagnosticMedicalDevices—MultiplexMolecularTestingforNucleicAcids—Part2:ValidationandVerification摘要随着精准医疗和分子诊断技术的飞速发展，多重分子检测技术在感染性疾病诊断、肿瘤基因分型、遗传病筛查及个体化用药指导等领域得到日益广泛的应用。多重分子试验能够在单一反应体系中同时检测多个核酸靶标，显著提高了检测效率和信息产出，然而其技术复杂性和结果判读的特殊性也对标准化验证与验证工作提出了更高要求。在此背景下，国际标准化组织（ISO）于2022年5月13日正式发布ISO21474-2:2022《体外诊断医疗器械核酸的多重分子试验第2部分：验证和验证》。该标准为多重分子检测系统的性能验证和验证提供了系统的技术框架和操作指南，是ISO21474系列标准的重要组成部分。本报告系统梳理了该标准的立项背景、编制历程、核心技术内容，深入分析了标准的主要技术要点和应用价值，并对其推广应用前景作出了展望。报告认为，ISO21474-2:2022的发布填补了国际范围内多重分子检测标准化验证与验证领域的空白，对提升多重核酸检测的质量水平、促进体外诊断产业的规范化发展具有重要的指导意义，也为我国相关标准体系建设和检测实验室能力提升提供了宝贵的技术参考。关键词：多重分子试验；验证与验证；体外诊断医疗器械；核酸扩增；标准化；性能评价Keywords:multiplexmoleculartesting;validationandverification;invitrodiagnosticmedicaldevices;nucleicacidamplification;standardization;performanceevaluation1标准立项背景与编制历程1.1行业需求驱动标准制定近年来，分子诊断技术经历了从单靶标核酸检测向多靶标平行检测的深刻转变。多重分子试验技术通过引入多色荧光标记、高分辨熔解曲线分析、数字PCR微滴阵列以及高通量测序等先进技术手段，实现了在同一反应管中对数十乃至数百个核酸靶标的同时检测和定量分析。诸如呼吸道病原体联合检测、胃肠道病原体筛查、HPV基因分型、血液筛查核酸检测以及肿瘤多基因突变检测等临床应用场景的不断拓展，使得多重分子检测已成为现代临床实验室不可或缺的核心技术平台。然而，多重分子试验系统的复杂性给实验室的质量管理带来了巨大挑战。相较于单靶标检测，多重检测体系涉及更多引物探针的组合优化、交叉反应的排除、检测阈值和判读算法的确定，以及多靶标间相互干扰的控制等问题。不同制造商的产品方案和不同实验室自建方法（LDT）之间缺乏统一的验证和验证标准，导致检测结果的可靠性和可重复性存在显著差异，临床解读面临潜在风险。为回应这一迫切的标准化需求，国际标准化组织ISO/TC212临床检验实验室和体外诊断系统技术委员会启动了ISO21474系列标准的研制工作。该系列标准旨在为核酸多重分子试验的开发、验证、验证及质量控制提供全过程的技术规范。1.2标准编制历程ISO21474-2:2022的编制工作经历了系统严谨的标准化研制流程。在ISO/TC212技术委员会的统筹协调下，来自各国标准化机构、临床检验专家、体外诊断产业界代表和监管机构的技术专家共同组成了工作组，围绕多重分子试验验证与验证的关键技术问题开展了深入研讨。标准从立项到正式发布历经多个阶段的国际标准研制程序，包括工作草案（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）等阶段。各阶段广泛征求了各成员国技术委员会的意见和建议，对标准的技术内容进行了充分论证和完善。最终，该标准于2022年5月13日正式发布，成为国际公认的多重核酸分子试验验证和验证的规范性技术文件。1.3标准定位与系列结构ISO21474系列标准构建了多部分标准结构。作为该系列的第2部分，ISO21474-2:2022聚焦于验证和验证这一环节，与第1部分（关于核酸提取和质量评价的通用要求）以及后续计划中的其他部分共同构成覆盖多重分子检测全流程的标准体系。这种模块化的标准结构设计既保证了各部分技术内容的深度和针对性，又实现了系列标准整体框架的一致性和相互协调。2标准适用范围与核心术语2.1适用范围ISO21474-2:2022明确规定了体外诊断医疗器械中核酸多重分子试验系统的验证和验证要求。适用对象主要包括：作为体外诊断医疗器械商业化的多重分子检测试剂盒、配套仪器设备的组合系统，以及部分实验室自建的多重分子检测方法。该标准适用于采用不同技术原理的多重分子试验，包括但不限于实时荧光定量PCR、数字PCR、等温核酸扩增、微流控芯片检测及高通量测序等平台。标准覆盖了定性和定量检测应用场景，并兼顾了临床样本直接检测和经核酸提取后的检测流程。2.2关键术语定义标准对验证和验证这两个核心概念给出了明确区分：验证（Verification）：指在制造商已确定的性能指标基础上，由用户实验室确认其自身条件下能够达到规定性能要求的过程。验证强调的是对既有声明指标的确认，通常涉及准确度、精密度、检测限、符合率等关键指标的确认性试验。验证（Validation）：指对检验程序的性能特征进行系统评估，以确定其是否满足预期用途要求的全过程。对于商业化试剂盒，用户实验室进行的验证相对简化；而对于实验室自建方法或对标准方法的实质性修改，则需要进行全面的验证，包括分析灵敏度、分析特异性、抗干扰能力、精密度、准确度及参考区间等系统评价。除了上述两个核心术语外，标准还系统定义了多重分子试验相关的其他技术术语，如分析灵敏度（检出限）、分析特异性、交叉反应、竞争性抑制、扩增效率、判读阈值等，为标准的统一理解和执行提供了术语学基础。3标准核心技术内容分析ISO21474-2:2022对多重分子试验验证和验证的技术要求进行了系统而详尽的规定，其核心内容涵盖以下几个主要技术模块。3.1验证和验证的通用要求标准首先确立了多重分子试验验证与验证活动的通用原则和质量管理要求。标准强调，所有的验证和验证活动应当在实验室质量管理体系的框架下进行，遵循ISO15189或同等质量管理要求。验证和验证活动应有明确的方案设计、实施程序和结果记录，并须形成完整的文档化记录以供审查和追溯。标准要求验证和验证活动应当在预期的临床使用条件下进行，充分考虑样本类型、样本处理方式、核酸提取方法以及检测平台等实际因素。所有验证和验证实验结果应当进行合理的统计分析，避免偶然误差对性能评估的影响。3.2分析性能的验证与验证分析性能的评价是多重分子试验验证和验证的核心内容。标准对以下关键分析性能指标的评价方法和技术要求作了具体规定：精密度：标准规定精密度的评价应涵盖重复性（批内精密度）和重现性（批间精密度/日间精密度），并要求在多个浓度水平（包括临界浓度附近）进行评价。对于多重检测靶标，每个靶标的精密度应分别予以评估。标准还建议综合运用方差分析等方法计算标准差和变异系数，并给出了可接受的精密度评价标准。分析灵敏度（检出限）：标准规定应确定每个靶标在多重检测体系中的检出限（LoD），并考虑多重反应体系中各靶标间的相互作用对检出限的潜在影响。推荐采用系列稀释法结合概率分析（如Probit回归分析）确定检出限，同时应验证在接近检出限浓度水平时各靶标的检出率。分析特异性：多重分子试验的分析特异性评价较单靶标检测更为复杂。标准要求系统评价引物和探针的交叉反应性，包括对近缘病原体、人基因组核酸、常见共生菌群以及样本中潜在干扰物质的反应性检测。对于多重体系内部各靶标之间的交叉反应和相互干扰，应予以重点关注。正确度：标准规定应通过与参考方法或参考物质的比对、分割样本检测方法、加标回收试验等方式对多重分子检测的正确度进行评价。对于定性检测，应计算诊断灵敏度、诊断特异性、阳性和阴性预测值等指标；对于定量检测，则应评估线性范围、定量限和偏差等参数。3.3多重体系特有的性能评价要求针对多重分子试验的技术特殊性，标准专门设置了如下特有的性能评价要求：多靶标间的干扰评价：多重检测体系中各靶标检测之间的相互干扰是影响检测质量的关键因素。标准要求系统评价高浓度靶标对低浓度靶标检测的竞争性抑制效应，模拟不同浓度组合的检测情形，确认多靶标同时存在时的检测性能不受显著影响。判读算法和阈值验证：多重分子检测的结果判读通常依赖于特定的计算算法和阈值设定。标准要求对结果判读算法的准确性进行验证，包括对扩增曲线分析的阈值设定、熔解曲线分析的判读标准、以及软件自动判读结果的可靠性进行系统性确认。组合标记的一致性评价：对于采用多色荧光标记和多重反应体系的产品，标准要求对各通道间的信号串扰进行评价和验证，确保各荧光通道的信号能够被准确区分和独立解读。3.4与预期用途相关的验证除了分析性能的系统评价之外，标准还要求结合预期临床用途进行验证，包括评价检测结果与临床状态的关联性、参考区间或临床决策阈值的适宜性、以及检测方法对特定适用人群和样本类型的适用性。这一要求确保了多重分子试验从分析性能到临床应用的全链条质量保障。4标准的实施意义与应用价值4.1推动行业技术规范化ISO21474-2:2022的发布为全球多重分子试验验证和验证工作提供了统一的技术参照。对于体外诊断制造商而言，该标准为产品注册和上市前性能评价提供了明确的技术框架，有助于简化多国注册申报过程中的技术资料准备。对于临床实验室而言，该标准为方法性能确认和日常质量控制提供了操作指南，有助于提升实验室自建方法的质量水平。4.2提升检测质量与结果可靠性多靶标检测体系的性能评价比单靶标体系具有更高的技术门槛和复杂程度。该标准系统化了性能评价的方法学路径，明确了各性能指标的评估方案和可接受判据，帮助实验室识别和规避多重体系特有的质量问题风险，从而有效保障检测结果的准确性和可重复性，为临床决策提供更为可靠的科学依据。4.3促进国际认可与结果互认作为一项国际标准，ISO21474-2:2022为各国监管机构和认可机构之间的技术协调奠定了基础。遵循该标准进行验证和验证的实验室，其检测能力更容易获得国际同行的认可，有助于促进检测结果的跨区域互认和质量管理体系的国际化接轨。4.4对我国的启示与借鉴目前，我国多重分子检测领域虽已有部分产品注册技术审查指导原则和专家共识可资参考，但在系统性、完整性方面仍存在一定的完善空间。ISO21474-2:2022为我国相关标准化工作提供了重要的参考蓝本。我国可在积极转化该国际标准的基础上，结合国内法规体系和产业实际，制定适应中国国情的多重分子试验验证与验证技术指南或行业标准，进一步提升我国分子诊断领域的标准化水平。同时，我国相关标准化技术委员会和行业组织可积极参与ISO/TC212的国际标准工作，在国际标准制定过程中发出中国声音、贡献中国智慧。5标准修订主要参与单位介绍ISO21474-2:2022的制定由ISO/TC212临床检验实验室和体外诊断系统技术委员会统筹组织，其工作组成员涵盖了国际知名的标准化机构、临床检验学术组织、体外诊断龙头企业、独立临床实验室以及政府监管机构。作为国际标准化体系中极具影响力的专业力量之一，美国临床实验室标准化协会（CLSI）在ISO21474-2:2022的研制过程中发挥了重要的技术支撑作用。CLSI作为全球公认的临床实验室标准化组织，长期以来致力于临床检验方法和质量管理的标准化研究，在分子诊断方法评价方面先后发布了多项具有广泛国际影响力的指南文件，为实验室方法验证和管理体系不断完善提供了关键技术指导和参考。在ISO21474-2的制定过程中，CLSI将其在分子检测方法性能评价领域积累的丰富技术经验和方法学成果贡献给国际标准工作组，包括精密度评价的实验设计策略、检出限确定的统计方法以及多靶标干扰评价的框架方案等，为标准技术内容的科学性、严谨性和可操作性提供了坚实的技术保障。与此同时，来自德国、日本、中国、英国、法国等国家的标准化技术专家和产业界代表在标准的讨论和完善过程中发挥了积极作用。各方围绕多重扩增中竞争性抑制的控制策略、各靶标检出限差异的协调、多通道荧光信号串扰的评价方法以及定性检测与定量检测验证策略的差异化处理等关键技术议题进行了充分的意见交流和技术研讨，为标准最终达成国际共识奠定了坚实基础。6结论与展望ISO21474-2:2022《体外诊断医疗器械核酸的多重分子试验第2部分：验证和验证》作为国际标准化组织发布的首个专门针对多重分子试验验证与验证的技术标准，填补了该细分领域国际标准体系的空白。该标准为多重核酸分子检测系统的分析方法验证和实验室验证提供了系统的技术框架和具体操作规范，对促进全球分子诊断产业的技术规范化发展和临床检验质量的持续提升具有重要意义。标准的核心价值体现在三个维度：在技术维度，它为多靶标平行检测这一复杂技术系统提供了科学系统的性能评价方法学；在管理维度，它将验证和验证活动纳入质量管理体系框架，强化了全流程质量控制的理念；在产业维度，它为体外诊断产品的研发、注册、生产和上市后评价提供了统一的技术标尺。参考文献[1]ISO21474-2:2022Invitrodiagnosticmedicaldevices—Multiplexmoleculartestingfornucleicacids—Part2:Validationandverification.Geneva:InternationalOrganizationforStandar