药品生物检定技术（第2版）课件 第二篇 第三章 无菌检查

第三章无菌检查法目录01概述02无菌检查法的基本步骤学习目标1.掌握无菌检查法的原理和操作流程。2.熟悉无菌检查法使用的培养基、菌种等。3.明确无菌检查在无菌制剂质量控制中的意义。知识目标1.能根据质量标准独立完成药品的无菌检查。2.熟练、规范进行无菌检查的抽样、取样。3.正确判断无菌检查的结果。能力目标1.树立无菌操作的意识。2.逐步养成规范、严谨、细致的实验操作习惯。素养目标案例分析——“欣弗”事件事发：2006年7月24日，青海省西宁市部分患者使用上海华源股份有限公司安徽华源生物药业有限公司（以下简称“安徽华源”）生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（即“欣弗”注射液）后，出现胸闷、心悸、心慌、寒战、腹泻、恶心、呕吐、过敏性休克等临床症状。随后，黑龙江、广西、浙江、山东等省区也分别报告发现类似病例。全国16个省区共报告“欣弗”病例93例，死亡11人。案例分析——“欣弗”事件原因：8月15日，国家食品药品监督管理局通报了“欣弗”事件的调查结果。导致这起不良事件的主要原因是，安徽华源2006年6月至7月生产的“欣弗”注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间、增加灭菌柜装载量（该药品按规定应经过105℃、30分钟的灭菌过程。但安徽华源擅自将灭菌温度降到100℃至104℃不等，将灭菌时间缩短到1到4分钟不等），影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明无菌检查和热原检查不符合规定。案例分析——“欣弗”事件反思：

药品作为一种特殊的商品，药品的质量安全直接关系到人们的健康和生命，必须做到100%合格。议一议什么是无菌检查？为什么注射液要进行无菌检查？第一节概述无菌检查法：

系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。无菌检查用薄膜过滤器一、无菌检查法的基本原理及意义无菌检查是利用无菌操作的方法，将被检查的药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。当供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染，也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。无菌检查方法薄膜过滤法适用于有抗菌作用或大容量的供试品直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行检查的供试品二、无菌检查法的环境要求无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域中进行。检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测。三、无菌检查法的适用范围无菌检查注射剂眼用制剂部分外用制剂吸入液体制剂可吸收的止血剂生物制品原液或半成品临床必需无菌的医疗器械体外用诊断制品半成品要求无菌的原料药第二节无菌检查法的基本步骤（一）抽样原则抽样时尽量抽取批生产开始、结束或生产过程出现异常情况下的产品进行检验，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。应采用随机抽样的原则进行无菌检查时的抽样。一、供试品抽样（二）检验数量和检验量检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无菌检查。检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容易内的内容物全部过滤。1.出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量供试品批产量N（个）接种每种培养基的最少检验数量注射剂≤10010%或4个（取较多者）100＜N≤50010个＞5002%或20个（取较少者）20个（生物制品）大体积注射剂（＞100ml）2%或10个（取较少者）20个（生物制品）冻干血液制品＞5ml每柜冻干≤2005个每柜冻干＞20010个冻干血液制品≤5ml≤1005个100＜N≤50010个＞50020个供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量眼用及其他非注射产品（单剂量包装的产品，按照注射剂供试品要求确定最小检验数量）≤2005%或2个（取较多者）＞20010个桶装无菌固体原料≤4每个容器4＜N≤5020%或4个容器（取较多者）＞502%或10个容器（取较多者）抗生素固体原料药（≥5g）6个容器生物制品原液或半成品每个容器（每个容器制品的取样量为总量的0.1%或不少于10ml，每开瓶一次，应如上法）体外用诊断制品半成品每批（抽样量应不少于3ml）医疗器械≤10010%或4件（取较多者）100＜N≤50010件＞5002%或20件（取较少者）2.上市抽验样品的最少检验数量供试品批产量N（个）液体制剂10固体制剂10血液制品V＜50mlV≥50ml62医疗器械103.供试品的最少检验量供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量液体制剂≤1ml全量1ml＜V≤40ml半量，但不少于1ml40ml＜V≤100ml20mlV＞100ml10%但不少于20ml＞50020个抗生素液体制剂1ml需混悬或乳化的不溶性制剂、乳膏剂和软膏剂取每支供试品，总量合计不少于200mg固体制剂M＜50mg全量50mg≤M＜300mg半量，但不得少于50mg300mg≤M＜5g150mgM≥5g500g半量（生物制品）供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量生物制品的原液及半成品半量医疗器械外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm×3cm缝合线、一次性医用材料整个材料带导管的一次性医疗器具（如输液袋）二分之一内表面积其他医疗器械整个器具（切碎或拆散开）二、操作过程（一）培养基

培养基是微生物生长的基础，根据无菌检查的原理，一种培养基很难满足所有菌的生长要求，所以无菌检查用培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基（用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养）和胰酪大豆胨液体培养基（用于真菌和需氧菌的培养）。1.培养基的制备

培养基可按处方配制，也可用市售按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基代替。使用脱水培养基时，按照使用说明书进行配制，配制培养基时称量要迅速，以免吸潮而影响称量的准确性。培养基配制好后，应澄清、无沉淀，并应采用验证合格的灭菌程序灭菌。2.培养基的保存

制备好的培养基若不即时使用，应放置于无菌密闭的容器中，在2～25℃、避光条件下保存，并在经验证的保存期内使用。培养基的配制器材的包扎培养基灭菌3.培养基的适用性检查目的：无菌检查用培养基的合格与否直接影响到试验结果的准确性与可靠性，因此在无菌检查正式进行前或在检测供试品的同时，应进行培养基的适用性检查，以确保无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。方法：无菌性检查和灵敏度检查。（1）无菌性检查：要求每批培养基随机抽取不少于5支（瓶），细菌培养基置于30～35℃培养14天，真菌培养基置于20～25℃培养14天，应均无菌生长。如有菌生产则应废弃，需重新配置。（2）灵敏度检查：培养基灵敏度检查是用已知的标准菌种来鉴定培养基的敏感度（6种），根据加入定量规定菌种的生长情况判定培养基灵敏度是否符合无菌检查的要求。加菌对照管均应生长良好。金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌（芽孢杆菌）生孢梭菌（厌氧菌）白色念珠菌（酵母菌）黑曲霉菌（霉菌）（二）稀释液、冲洗液制备方法0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。2.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，灭菌。（三）方法验证试验

在确定产品的无菌检测试验方法时，或建立新的检测方法时，以及试验条件发生更改时，都必须对新的或更改后的方法加以验证，以确定供试品在该试验条件下有无抑菌活性，验证试验条件是否符合要求，保证该试验条件下检测结果的准确有效。菌种金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕生孢梭菌〔CMCC(B)64941〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕黑曲霉〔CMCC(F)98003〕大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕1.菌种及菌液的制备注：对大肠埃希菌敏感的抗生素类产品宜选用大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌2.验证方法（1）直接接种法

培养基准备：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。

供试品管、对照管：上述两管培养基中1管按供试品的无菌检查要求，接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过3～5天。供试品管对照管另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌，过滤。加培养基至滤筒内硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌胰酪大豆胨液体培养基枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌（2）薄膜过滤法置规定温度培养，培养时间不得超过5天。3.结果判断将供试品管与对照管相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。4.消除抑菌作用的方法（1）可增加滤膜的冲洗量，但每片滤膜的总量不宜过大，以免影响滤膜上微生物的生长情况。（2）使用相对应的中和剂，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。（3）有些供试品有抑菌作用或含有抑菌物质而又没有适当的中和剂，可加大培养基的使用量，将供试品稀释至不具抑菌作用的浓度即可。（四）阳性对照和阴性对照

1.阳性对照阳性对照试验是检查阳性对照菌在加入供试品的培养基中能否生长，以验证供试品有无抑菌活性物质和试验条件是否符合要求的试验。阳性对照菌的生长证明无菌检查试验所使用的技术条件恰当，否则试验无效。根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备与方法适用性试验相同，加菌量不大于100cfu，供试品用量与供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量相同，对照管培养不超过5天，应生长良好。2.

阴性对照

供试品无菌检查时，取相应稀释液和溶剂、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。（五）供试品的无菌检查供试品的无菌检查分为薄膜过滤法和直接接种法。前者适用于任何类型药品的无菌检查，后者适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。操作时，应先用适宜的方法对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可以用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。1.薄膜过滤法薄膜过滤法是各国药典和《中国药典》规定的无菌检测的方法，适用于任何类型药品的无菌检查，具有适用性广、准确性高的特点。薄膜过滤器（1）原理

供试品通过集菌仪的定向蠕动加压作用，实施正压过滤并在滤器内进行培养，用以检测供试品是否无菌。供试品通过进样管连续被注入集菌培养器中，利用集菌培养器内形成的正压，通过0.2μm或0.45μm孔径的滤膜过滤，供试品中可能存在的微生物被截留收集在滤膜上，通过冲洗滤膜除去抑菌成分。然后把所需培养基通过进样管直接注入集菌培养器中，放置于规定的温度下培养，观察是否有菌生长。（2）薄膜过滤器

薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器。它是由一个具有蠕动泵头的集菌仪和一套具有3个或2个培养瓶的一次性使用的全封闭集菌培养器构成的过滤系统。将一次性集菌培养器（依供试品种类选择适宜的集菌培养器）放置于集菌仪的架上，而塑胶软导管放置于集菌仪的蠕动泵的管槽内，其进液管的双芯针头插入供试液或冲洗液等容器的塞上。（3）基本操作

无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，滤膜直径约为50mm，若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。薄膜过滤法检测供试品时，应根据不同供试品采用不同的处理方法。例如，水溶性供试品可取规定量直接过滤或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀过滤。（4）培养及观察

将接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天；接种生物制品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30~35℃培养，一份置20~25℃培养。

培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。

如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液不少于1ml转种至同种新鲜培养基中，将原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于4天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。2.直接接种法

相对于薄膜过滤法，直接接种法具有操作简便、所需仪器设备少，适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。（1）供试品的接种：取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无