药品生物检定技术（第2版）课件 第11-13章 疫苗的质量控制与生物活性检定、酶类药物的生物活性检定、其他常见药物的生物活性检定

第十一章疫苗的质量控制与生物活性检定目录01概述02乙肝疫苗及其体外相对效力检查学习目标1.掌握疫苗的概念及分类、质量标准要求。2.熟悉常见疫苗（如乙肝疫苗）的生物活性检定方法。知识目标1.学会酶联免疫吸附法的基本操作。2.能够读懂、理解生物试剂盒的说明书。能力目标具备按照标准操作规程、操作步骤进行独立操作的意识。素养目标第一节概述疫苗是以病原微生物或其组成成分、代谢产物为起始材料，采用生物技术制备而成，用于预防、治疗人类相应疾病的生物制品。疫苗具有免疫活性，接种人体后可刺激免疫系统产生特异性体液免疫和（或）细胞免疫应答，使人体获得对相应病原微生物的免疫力。一、疫苗的概念1.灭活疫苗系指病原微生物经培养、增殖，用理化方法灭活以去除其增殖能力后制成的疫苗，如钩端螺旋体疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等。2.减毒活疫苗系指采用病原微生物的自然弱毒株或经培养传代等方法减毒处理后获得致病力减弱、免疫原性良好的病原微生物减毒株制成的疫苗。二、疫苗的种类3.亚单位疫苗系指病原微生物经培养后，提取、纯化其主要保护性抗原成分制成的疫苗，如A群脑膜炎球菌多糖疫苗、流感亚单位疫苗等。4.基因工程疫苗系使用重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因重组到细菌（如大肠埃希菌）、酵母或细胞，经培养、增殖后，提取、纯化所表达的保护性抗原制成的疫苗，如重组乙肝型肝炎疫苗。二、疫苗的种类接种疫苗是预防和控制传染病的重要手段，通过适宜途径将疫苗接种于人体，使受种者产生针对疾病的特异免疫力，可抵御病原微生物侵袭而起到预防作用。

为更好地发挥疫苗的防病作用，需制定相应的免疫规划和免疫策略，并根据疾病的流行特征及疫苗的特性和效能制定免疫程序。表11-1列出了国家免疫规划的疫苗及预防的疾病种类（2021年版）。表11-2列出了部分国家非免疫规划的疫苗及预防的疾病种类。三、疫苗的应用表11-1

国家免疫规划疫苗与预防的疾病种类（2021年版）序号疫苗种类预防传染病种类英文缩写接种途径1乙肝疫苗乙型病毒性肝炎HepB肌内注射2卡介苗结核病（主要指结核性脑膜炎、粟粒性肺结核等）BCG皮内注射3脊灰灭活疫苗脊髓灰质炎IPV肌内注射4脊灰减毒活疫苗bOPV口服5百白破疫苗百日咳、白喉、破伤风DTaP肌内注射6白破疫苗DT肌内注射7麻腮风疫苗麻疹、风疹、流行性腮腺炎MMR皮下注射8乙脑减毒活疫苗流行性乙型脑炎JE-L皮下注射9乙脑灭活疫苗JE-I肌内注射10A群流脑多糖疫苗流行性脑脊髓膜炎MPSV-A皮下注射11A群C群流脑多糖疫苗MPSV-AC皮下注射12甲肝减毒活疫苗甲型病毒性肝炎HepA-L皮下注射13甲肝灭活疫苗HepA-I肌内注射14双价肾综合征出血热灭活疫苗出血热EHF肌内注射15人用炭疽活疫苗炭疽Anth皮上划痕16钩端螺旋体疫苗钩体病Lep皮下注射表11-2

部分国家非免疫规划疫苗与预防的疾病种类序号疫苗种类预防传染病种类接种途径123价肺炎球菌多糖疫苗肺炎链球菌引起的肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等肌内注射2b型流感嗜血杆菌结合疫苗b型流感嗜血杆菌引起的感染肌内注射3流感全病毒灭活疫苗流感病毒裂解疫苗流感肌内注射4双价人乳头瘤病毒疫苗人乳头瘤病毒感染肌内注射5冻干人用狂犬病疫苗狂犬病肌内注射6水痘减毒活疫苗水痘皮下注射

《中国药典》2025年版人类疫苗总论对疫苗的过程控制进行了详细规定，加强了对疫苗生产的原材料、生产过程的监管，从而减少疫苗应用事故的发生。对疫苗的生产和使用全过程进行严格的质量控制，有效确保疫苗的安全性、有效性、可控性和一致性。1.全过程质量控制2.批间一致性的控制3.目标成分及非目标成分的控制四、疫苗的过程控制第二节乙肝疫苗及其体外相对效力检查

1985年，我国开始使用血源乙肝疫苗，1992年研制成功重组中华仓鼠卵巢细胞乙肝疫苗。同期从美国Merck公司引进的重组酵母乙肝疫苗于1993年完成中间试制，1995年获准生产。1998年后淘汰了血源乙肝疫苗，目前用于免疫接种的有三种重组乙肝疫苗（酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞）。一、乙肝疫苗及其发展本品系由重组CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加入氢氧化铝佐剂制成。二、重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）体外相对效力检查法（一）检查前准备1.仪器、设备：移液器及配套枪头、天平、量筒等；生物安全柜、涡旋混合器、离心机、酶标仪、水浴锅等。2.试剂：PBS，供试品处理液。3.参考品溶液及供试品溶液。（二）检查法（ELISA法）

本法系以酶联免疫吸附法（ELISA法）测定供试品中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）含量，并以疫苗参考品为标准，采用双平行线分析法计算供试品的相对效力。使用时按试剂盒说明书进行。1.平衡2.编号3.稀释

加稀释液。4.加样

分别加待测样本、阴性对照、阳性对照。5.温育37℃，60分钟。6.洗涤

缓冲液洗涤5次。7.加酶

酶标抗体。8.温育37℃，60分钟。9.洗涤

缓冲液洗涤5次。10.显色

加底物A、底物B，混匀，暗处放置30分钟。11.终止

加终止液。12.测定

阴性和阳性对照吸光度均值应在试剂盒要求范围内，试验有效。3次测定数据采用量反应平行线测定法计算。几何平均值作为最终结果。以参考品为标准，供试品相对效力应不小于0.5，判为合格。三、结果判断如果供试品疫苗有摇不散的块状物、疫苗容器有裂纹、标签不清或过期失效者，均不做为检测对象。供试品疫苗于2～8℃下避光保存。试验时的室温应保持在20～30℃，过高或过低均可影响试验结果。四、注意事项谢谢观看第十二章酶类药物分析目录01概述02胃蛋白酶的活力测定学习目标1.掌握酶类药物的基本概念、分类。2.掌握酶类药物典型代表——胃蛋白酶的活力测定方法，理解其测定原理。3.熟悉酶类药物鉴别、检查、活力测定的常用方法。知识目标1.独立且规范进行胃蛋白酶的活力测定操作。2.结合酶类药物的性质，根据《中国药典》对该类药物进行鉴别、检查和活力测定。能力目标1.提高遵守药品国家标准、法律法规的自觉意识。2.养成严守标准、严谨求实的科学精神。素养目标1783年，意大利科学家斯巴兰让尼设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼内，然后让老鹰把小笼子吞下去，这样，肉块就可以不受胃的物理性消化的影响，而胃液却可以流入笼内。

过一段时间后，他把小笼子取出来，发现笼内的肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉的物质。第一节概述一、酶类药物概述1.概念：生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。2.分类助消化酶类

胃蛋白酶等蛋白水解酶类

糜蛋白酶、溶菌酶等凝血酶及抗栓酶

尿激酶、链激酶等抗肿瘤酶类L-天冬酰胺酶等其他酶类

细胞色素C、SOD、抑肽酶等辅酶：CoQ10等。二、酶类药物鉴别（一）蛋白质显色反应：双缩脲反应（二）酶活性试验：酶与特异性底物结合（三）沉淀试验：酶与有机酸或重金属盐反应（四）动物试验：动物体内某些指标或特征变化（五）标准品对照法：供试品与相应标准品同法测定、对比。三、酶类药物检查

酶类药物的检查项目有多项与一般生物化学药物的检查项目和检查方法相同。如酸碱度、溶液的澄清度与颜色、干燥失重、炽灼残渣、重金属、热原、异常毒性、降压物质等。其他检查项目：

（一）脂肪含量限度检查（二）其他酶类含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查四、酶类药物活力测定

酶的活性效价由其氨基酸序列及空间结构决定，往往与酶的绝对质量不一致。因此，与化学药物以含量测定结果评价药效不同，酶类药物的药效评定不能直接用重量单位来确定。如果一种酶失去了生物学活性，那么即使绝对质量再多，也无法发挥作用，因此酶的定量只能用酶活力来表示。（一）酶的活力单位酶活力指酶催化生化反应的能力，是反映酶活性的指标，其大小可以用一定条件下酶所催化的某一化学反应的反应速率来表示：以酶作用后底物或产物浓度的变化值为检测指标，进而计算该酶制品的酶活力。酶的活力单位用以量度酶活力的大小，用U表示。（二）酶活力测定的原理酶活力测定是酶法分析中的重要内容之一。进行酶法分析时，第一步是进行酶促反应，即将酶与相应底物接触，并在适当条件下（温度、pH等）进行催化反应；第二步是测定酶促反应前后的物质变化情况，如检测底物浓度的减少量、产物浓度的增加量、辅酶的浓度变化等。常用的酶法分析包括终点法、速度法和酶循环放大分析法。1.终点法（1）单酶反应定量法①底物减少量的测定②产物增加量的测定③辅酶变化量的测定（2）和指示酶反应偶联的定量法①当被分析的反应产物和底物无法用物理化学手段区分时，可借助酶的特异反应来加以识别。在这种情况下，如该酶可用作指示酶反应，就有可能通过和它偶联进行定量分析。②如果所用酶的专一性不强，同时样品中还夹杂有可作为它们底物的其他物质，这时单用一种酶很难进行定量，需要再偶联一个酶，通过偶联酶的专一性才能实现区别定量。2.反应速度法（1）一般反应速度测定法：测定底物、辅酶或抑制剂的含量。（2）特殊的反应速度测定法：偶联，测定第三种指示剂酶的反应速度。3.酶循环放大分析法

酶法分析因具有较强的特异性和很高的灵敏度，一直是生物药物定量分析的常用方法。然而，对于含量极微少的物质，若采用酶法直接定量，却受到灵敏度的限制，甚至不能采用常规的终点法。因此，采用酶循环放大法则可进行测定。酶循环放大法仍然利用酶对底物的专一性，使微量的底物“增幅放大”以达到定量分析目的。从理论上讲，酶法分析这种化学性放大作用可无限放大。目前，酶循环放大分析法定量限度可达10-15～10-18mol。（三）酶活力测定的方法按酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物（如H+、OH-、ATP、CO2、H202等）选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。

1.容量分析法若酶促反应中，反应底物或产物之一具有特定电化学性质，可以采用相应的某种已知准确浓度的试剂溶液（滴定液）对其进行滴定，直到所加的滴定液与被测的反应底物或产物按化学计量关系完全反应为止，然后根据消耗的滴定液的浓度和用量，计算出反应底物或产物的含量，进而推算出酶的活力。例如抑肽酶的测定。2.气体检测法若酶促反应能产生气体时，可以将生成气体的变化量作为检测指标，计算酶的活力。例如尿激酶的测定。3.分光光度法若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的吸光度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶等。例如糜蛋白酶的测定。4.粘度测定法若酶促反应中，反应产物或底物之一具有某种可以指示反应变化的物理特性，也可利用其物理特性的改变来测定酶的活力。例：英国药典，玻璃酸酶。第二节胃蛋白酶的活力测定胃蛋白酶概念：

胃蛋白酶原胃蛋白酶作用原理：蛋白质小肽、酪氨酸、苯丙氨酸胃酸活化

水解来源：猪、牛、羊胃中提取；性状:白色或淡黄色的粉末，无霉败臭，有引湿性，水溶液显酸性反应；鉴别:水溶液加鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液，可产生沉淀；保存：

在低温环境中（-20℃至-80℃）保存，以防止其发生自降解，或储存于pH11的溶液中或对其进行还原性甲基化也可以有效防止自降解的发生，当pH6时，胃蛋白酶的活性即可恢复；临床应用：

消化不良；消化性溃疡禁用此药。胃蛋白酶活力测定原理：

用血红蛋白作为底物，在规定的实验条件下，利用胃蛋白酶催化水解血红蛋白生成水解产物（小肽及酪氨酸等氨基酸），准确反应一定时间。在一定范围内，其溶液紫外吸光度与胃蛋白酶活力成一定比例，用酪氨酸作对照品，以确定胃蛋白酶的活力单位。试剂：

盐酸溶液血红蛋白试液三氯醋酸溶液溶剂底物终止反应对照品溶液、供试品溶液的制备：对照品对照品供试品浓度约为0.5mg/ml的酪氨酸对照品溶液每1ml中约含0.2～0.4单位的供试品溶液测定法：37℃±0.5℃水浴

对照品3支供试品3支对照品空白供试品空白测定法：

取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1ml，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。

另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm的波长处测定吸光度，算出平均值`As和`A。计算公式：式中，`As为对照品的平均吸光度；

A为供试品的平均吸光度；

Ws为每1ml对照品中含酪氨酸的量，μg；

W为供试品取样量，g；n为供试品稀释倍数。

在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力的单位。

注：按干燥品计算，每1g中含胃蛋白酶活力不得少于3800单位。课后练一练

精密称取酪氨酸对照品0.05122g，加盐酸溶液溶解并稀释至100ml，作为对照品溶液。取胃蛋白酶（干燥品）0.1379g，加盐酸溶液溶解并稀释至100ml，精密量取5ml至100ml量瓶中，用盐酸溶液稀释至刻度，作为供试品溶液。照胃蛋白酶效价测定法，测得对照品溶液的平均吸光度为0.531，供试品溶液的平均吸光度为0.526，请计算胃蛋白酶样品的效价？谢谢观看第十六章其他常见药物的生物活性检定目录01人凝血因子Ⅷ02人凝血酶原复合物03肝素学习目标1.掌握凝血因子类血液制品和肝素生物测定的实验过程。2.熟悉凝血因子类血液制品和肝素生物测定的原理。3.了解凝血因子类血液制品和肝素基本的临床应用。知识目标1.能根据标准操作规程，规范进行肝素的生物测定操作。2.提高读懂、理解《中国药典》等质量标准的能力。能力目标1.养成勤于思考、善于思维的学习习惯。2.培养严格依规操作的职业理念。素养目标凝血机制人凝血机制示意图主要凝血因子因子I，纤维蛋白原因子II，凝血酶原因子Ⅲ，组织因子因子Ⅳ，钙离子因子Ⅴ，促凝血球蛋白原因子Ⅶ，促凝血酶原激酶原因子Ⅷ，血友病因子A因子Ⅸ，血友病因子B因子Ⅹ，自体凝血酶原C因子ⅩⅠ，抗血友病球蛋白C因子ⅩⅡ，表面因子因子ⅩⅢ，血纤维稳定因子抗凝血药物作用机制抗凝血药物种类凝血酶间接抑制药：肝素类凝血酶直接抑制药：香豆素类、水蛭素纤维蛋白溶解药：链激酶、尿激酶、阿尼普酶抗血小板药：阿司匹林、双嘧达莫、依前列醇、噻氯吡啶第一节人凝血因子Ⅷ人凝血因子Ⅷ效价测定受检测方法的影响较大，常用的方法为基于活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）的一期凝固法。其原理是在37℃件下，在受检血浆中加入APTT试剂（XII因子激活剂和脑磷脂），以白陶土激活Ⅻ因子，最后加入钙离子后，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间。它对除Ⅶ因子以外所有的凝血因子都很敏感。《中国药典》2025年版四部也收载了第二法生色底物法。检定方法：取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温4分钟，加入凝血因子Ⅷ缺乏血浆0.1ml、标准品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温5min。加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用不同浓度的供试品溶液0.1ml替代标准品溶液，同法操作。

以系列标准品溶液（或系列供试品溶液）效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作线性回归，照生物检定统计法（《中国药典》2025年版四部通则1431）中的量反应平行线测定法计算供试品效价及95%置信区间，其95%置信区间应在测得效价的80%～120%。供试品溶液和标准品溶液的剂量反应曲线回归项应非常显著（P＜0.01），偏离平行和偏离线性均应不显著（P≥0.01）。注意事项：1.自“用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆或0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ的溶液”起，依法操作，独立制备2份系列标准品溶液和供试品溶液，平行测定。同一浓度的两份溶液凝固时间的相对偏差不得过10%，否则应重测。2.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。3.如采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。4.偏离线性项变异的差方和与自由度（ƒ）计算公式：第二节人凝血酶原复合物人凝血酶原复合物（PCC）是由健康人血浆经分离纯化制成的凝血因子提取物，主要含有凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ。四种凝血因子具有极其相似的相对分子质量和等电点等理化性质，在规模生产时难以使用常规的分离手段将它们分离，故一般的商品皆含有上述四种因子。临床上PCC主要用于治疗乙型血友病和因维生素K缺乏或患肝病而引起的出血症状。人凝血酶原复合物的效价测定是分别测定人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的效价。

《中国药典》2025年版中，人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ三种因子的效价测定均是以人凝血因子缺乏血浆为基质血浆，采用基于血浆凝血酶原时间（prothrombintime，PT）的一期凝固法。其原理是在被检血浆中加入钙离子和组织因子（TF或组织凝血活酶），使凝血酶原转化为凝血酶,后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，观测血浆的凝固时间。它是外源凝血系统较为灵敏和最为常用的筛查试验。一、人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ检定方法

量取供试品溶液0.1ml，加待测人凝血因子缺乏血浆0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般3分钟），然后加入已预热至37℃的含钙促凝血酶原激酶溶液0.2ml，记录凝固时间。用不同稀释度的待测人凝血因子标准品溶液0.1ml替代供试品溶液，同法操作。以待测人凝血因子标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作直线回归，求得直线回归方程，计算供试品溶液待测人凝血因子效价，再乘以稀释倍数，即为供试品待测人凝血因子效价（IU/ml）。注意事项：1.直线回归相关系数应不低于0.98。2.测定时要求每个稀释度平行测定2管，2管之差不得超过均值10%，否则重测。3.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。4.采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。人凝血因子Ⅸ效价的测定方法与人凝血因子Ⅷ类似，采用基于活化部分凝血活酶时间（activatedpartialthromboplastintime，APTT）的一期凝固法和生色底物法。二、人凝血因子Ⅸ检定方法检定方法：

取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间（一般4分钟），加入凝血因子Ⅸ缺乏血浆0.1ml、标准品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般5分钟），加入已预热至37℃的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。用不同浓度的供试品溶液0.1ml替代标准品溶液，同法操作。

以系列标准品溶液（或系列供试品溶液）效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数作线性回归，照生物检定统计法（《中国药典》2025年版四部通则1431）中的量反应平行线测定法计算供试品效价及95%置信区间，其95%置信区间应在测得效价的80%～125%。供试品溶液和标准品溶液的剂量反应曲线相关系数均应不低于0.98，回归项应非常显著（P＜0.01），偏离平行和偏离线性均应不显著（P≥0.01）。注意事项：1.自“用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆或0.85%~0.90%氯化钠溶液稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅸ的溶液”起，依法操作，独立制备2份系列标准品溶液和供试品溶液，平行测定。同一浓度的两份溶液凝固时间的相对偏差不得过10%，否则应重测。2.直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。3.如采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。4.偏离线性项变异的差方和与自由度（f）计算公式：第三节肝素肝素是哺乳动物体内含有的一种天然酸性黏多糖，它与蛋白质结合成复合体的形式存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，故不显抗凝血作用。肝素与蛋白质分离提取后，具有抗凝血、抗血栓、降血脂等多种生理活性，是防止动脉粥样硬化、心脑血管疾病的有效药物。低分子肝素是由普通肝素解聚制备而成的一类分子量较低的肝素的总称。普通肝素平均分子量为15000Da，分子量小于6000Da的统称为低分子肝素。肝素钠效价测定，以前大多采用凝血时间测定法。从《中国药典》2015年版二部中，将抗Ⅱa因子/抗Xa因子效价测定法被纳入肝素钠、肝素钙效价测定项下，2025年版中，本法作为通则1208肝素生物测定法中的第一法，凝血时间测定法为第二法。一、抗Ⅱa因子/抗Xa因子效价测定法

本法系通过微量显色法比较肝素标准品与供试品抗Ⅱa因子和抗Xa因子的活性，以测定供试品的效价。（一）抗Ⅱa因子测定法

按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次分别精密加入20~100μl相同体积的上述溶液；每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入凝血酶溶液适量，混匀，37℃平衡2min；再精密加入发色底物溶液适量，混匀，37℃保温2min后，再精密加入50%醋酸溶液适量（2V）终止反应，迅速冷却至室温。405nm的波长处测定各管吸光度。按照量反应平行线原理4·4法实验设计，计算效价及实验误差。

本法的可信限率（FL%）不得大于10%。（二）抗Ⅹa因子测定法

按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次分别精密加入20~100μl相同体积的上述溶液；每管精密加入相同体积的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟；再精密加入Xa因子溶液适量，混匀，37℃平衡2min；再精密加入发色底物溶液适量，混匀，37℃保温2min后，再精密加入50%醋酸溶液适量（2V）终止反应，迅速冷却至室温。405nm的波长处测定各管吸光度。按照量反应平行线原理4·4法实验设计，计算效价及实验误差。

本法的可信限率（FL%）不得大于10%。（三）凝血时间测定法1．兔全血法