CN119403831A 包含nrp1结合结构域的双特异性抗体及其使用方法 （松树治疗公司）

2024.11.29PCT/US2023/0169632023.03.30WO2023/192514EN2023.10.05包含NRP1结合结构域的双特异性抗体及其本公开提供了双特异性抗体和并入所述双异性抗体包括包含EGFR结合结构域和在C端末端处的神经纤毛蛋白(NRP1)特异性结合结构域的2(i)HCDR1由SEQIDNO:79中显示的序列组成，HCDR2由SEQI3.一种双特异性抗体，其包含结合人神经纤毛蛋白_15.权利要求4的双特异性抗体，其中所述第构域(VH)和重链恒定1结构域(CH1)，并且所述第一结合结构域包含C端NRP1结合单链可变6.权利要求5的双特异性抗体，其中所述第二结合结构7.权利要求6的双特异性抗体，其中所述C端NRP1结8.权利要求7的双特异性抗体，其进一步包含相应的EGFR结合轻链可变结构域(VL)和310.权利要求13任一项的双特异性抗体，其中所述第一结合结构域包含含有SEQIDNO:77中显示的序列的VH结构域和含有SEQIDNO:78中显示的序列的VL结构域包含含有SEQIDNO:69中显示的序列的VH结构域和含有SEQIDNO:70中显示的序列的13.权利要求12的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体重链与包含SEQIDNO:12所14.权利要求13的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体重链包含SEQIDNO:11或39中显示的氨基酸序列，并且所述双特异性抗体轻链包含SEQIDNO:12中显示的氨基酸序16.权利要求4的双特异性抗体，其中所述NRP1结合结构域的结合亲和力(KD)范围在24.一种通过细胞内化表皮生长因子受体(EGFR)的方法，所述方法包括使所述细胞与25.一种治疗受试者中与异常NRP1表达相关的癌症的方法，所述方法包括向所述受试26.一种治疗受试者中与异常EGFR表达相关的癌症的方法，所述方法包括向所述受试28.权利要求26的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用至少一种用于组合疗29.根据权利要求1所述的双特异性抗体430.根据权利要求4所述的双特异性抗体在制造用于治疗与异常EGFR表达相关的癌症5[0001]本申请要求2022年3月30日提交的美国临时申请号63/325,312和2022年3月30日阻碍了渗透穿过内皮屏障，2)高肿瘤间质液压力；和3)肿瘤组织的异常微观结构/生理性质，包括减少的灌注和异常血管生成、低淋巴管形成、高细胞密度和高细胞外密度(Jain够使抗体在肿瘤组织中选择性积累并具有高渗透肿瘤组织的能力的抗体技术将降低毒性肿瘤组织渗透的分子组合来改善肿瘤渗透。例如，抗体片段，诸如抗原结合片段(Fab)合人神经纤毛蛋白一1受体(NRP1)的第一结合结构域和结合人表皮生长因子受体(EGFR)的有高亲和力的EGFR×NRP1双特异性抗体，以提供对表达EGFR的肿瘤的高归巢(homing)能6[0007]在一方面，本公开涉及一种双特异性抗体，其包含结合人神经纤毛蛋白_1受体CDR3区(分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗体轻链可变(VL)结构域，其中LCDR1由SEQIDNO:80中显示的序列组成，以及HCDR3由SEQIDNO:84任一个中显示的序列组成；和(ii)LCDR3由SEQIDNO:89中显示的序列组合结构域包含N端EGFR结合重链可变结构域(VH)和重链恒定1结构域(CH1)，并且第一结合结构域包含C端NRP1结合单链可变片段(scFv)，其中N端可变重链(VH)和C端scFv结合结构述第一结合结构域包含含有SEQIDNO:77中显示的序列的VH结构域和含有SEQIDNO:78包含含有SEQIDNO:77中显示的序列的VH结构域和含有SEQIDNO:78中显示的序列的VL7[0015]在双特异性抗体的某些实施方案中，EGFR结合结构域的结合亲和力(KD)为<0.1nM。在某些实施方案中，NRP1结合结构域的的结合亲和[0019]在另一方面，本公开涉及一种治疗受试者中与异常NRP1双特异性抗体在制造用于治疗与异常EGFR表达相关的癌症的药物[0022]图1A通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:1的bsAb与重组人[0023]图1B通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:2的bsAb与重组人8[0024]图1C通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb与重组人[0025]图1D通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb与重组人[0026]图1E通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb与重组人[0027]图1F通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb与重组人[0028]图1G通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb与重组人[0029]图1H通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:8的bsAb与重组人[0030]图1I通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:9的bsAb与重组人[0031]图1J通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:10的bsAb与重组人EGFR的结合描绘了肿瘤相关受体靶向抗体的剂量依赖性结合。图上的每条线表示特定[0032]图1K通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:11的bsAb与重组人EGFR的结合描绘了肿瘤相关受体靶向抗体的剂量依赖性结合。图上的每条线表示特定[0033]图2A通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:1的bsAb与重组[0034]图2B通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:2的bsAb与重组[0035]图2C通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb与重组[0036]图2D通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb与重组9[0037]图2E通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb与重组[0038]图2F通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb与重组[0039]图2G通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb与重组[0040]图2H通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:8的bsAb与重组[0041]图2I通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:9的bsAb与重组[0042]图2J通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:10的bsAb与重组[0043]图2K通过OctetRed96传感图测得的具有重链多肽SEQIDNO:11的bsAb与重组[0044]图3通过使用抗磷酸化VEGFR2(Y1175)检测磷酸化VEGFR2，显示与具有重链多肽[0045]图4A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:2的bsAb抑制VEGFR2信号传导的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:2的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓J软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:2的bsAb的抑制作用。[0046]图4B使用Prism9计算具有重链多肽SEQIDNO:2(n＝2)的bsAb在VEGFR2磷酸化中[0047]图5A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb抑制VEGFR2信号传导的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓J软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb的抑制作用。[0048]图5B具有重链多肽SEQIDNO:3的bsAb(n＝2)VEGFR2磷酸化抑制的IC50图。使用[0049]图6A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb介导的VEGFR2信号传导抑制的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓度)一起预温育30分钟，并用VEGF165(2.2ng/ml)再处理10分钟以诱导VEGFR2激活。ImageJ软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb的抑制作用。[0050]图6B具有重链多肽SEQIDNO:4的bsAb(n＝2)VEGFR2磷酸化抑制的IC50图。使用[0051]图7A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb抑制VEGFR2信号传导的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓J软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb的抑制作用。[0052]图7B具有重链多肽SEQIDNO:5的bsAb(n＝1)在VEGFR2磷酸化抑制中的IC50图。[0053]图8A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb抑制VEGFR2信号传导的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓J软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb的抑制作用。[0054]图8B具有重链多肽SEQIDNO:6的bsAb(n＝2)在VEGFR2磷酸化抑制中的IC50图。[0055]图9A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb抑制VEGFR2信号传导的剂量反应。将HUVEC细胞与具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb(从1μM开始的6倍连续稀释浓J软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb的抑制作用。[0056]图9B具有重链多肽SEQIDNO:7的bsAb(n＝2)在VEGFR2磷酸化抑制中的IC50图。[0057]图10A蛋白印迹密度显示具有重链多肽SEQIDNO:11的bsAb抑制VEGFR2信号传导抗磷酸化VEGFR2(Y1175)，通过裂解物的蛋白印迹检测VEGFR2信号传导激活。通过使用ImageJ软件光密度法分析(数字显示在P_VEGFR2(Y1175)印迹下方)将条带强度与VEGF165对照裂解物进行比较来计算具有重链多肽SEQIDNO:11的bsAb的抑制作[0058]图10B具有重链多肽SEQIDNO:11的bsAb(n＝2)在VEGFR2磷酸化抑制中的IC50[0059]图11Al在具有重链多肽SEQIDNO:1的bsAb存在下H1975细胞相对于对照的生长[0061]图12A用PBS(对照)和具有重链多肽SEQIDNO:1的bsAb(10mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的平均肿瘤生bsAb(5mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的bsAb(6.825mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的bsAb(6.85mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的bsAb(6.85mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的和11的bsAb(6.86mg/kg,ip,BIW)治疗的H1975异种移植小鼠模型中的平[0068]图14用IgG1同型对照、构建体11bsAb或构建体12bsAb治疗的H1975异种移植小鼠[0071]图17与单独的抗NRP1、单独的抗EGFR、或组合的抗NRP1+抗EGFR相比，由构建体(例如如本文中所述的)向受试者递送如本文中描述的本发明的多肽或组合物或其前药或列可以包括氨基酸序列(GGGGS)n，其中n定义重复的数目。亚基重复的数目限定接头肽柔效量。例如，本文中描述的双特异性抗体可以以每周或每两周间隔，以范围在约0.01至都可以通过计算浓度以及缔合和解离的实际速率来确定，(参见Nature361:186_87变区结构域(VH)，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列，以及三个包括全长轻链，所述全长轻链包括轻链可变区结构域(VL)，其包括具有足以赋予抗原特异是指当最佳地比对和比较时相同(具有用于最佳比对的适当插入或缺失)的位置的百分比一性相同位置的#/位置的总#×100)，考虑为了进行两个序列的最佳比对而必须引入对公共数据库进行检索，以例如鉴定相关序列。此类检索可以使用Altschul等人,所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序(例如如一种或多种预防剂和/或治疗剂)。该术语的使用不限制向受试者施用疗法(例如预防剂异性抗体上的具体取代基)制备的活性双特物理性质。提及赋形剂包括一种和超过一种此类赋形剂。合适的药物赋形剂描述在号传导驱动许多癌症类型的增殖和细胞存活，包括乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌EGFR信号传导激活下游信号传导级联，包括导致增殖和癌细胞存活的RAS_RAF_MEK_ERK和细胞毒性(ADCC)，并通过激活嗜中性粒细胞和单核细胞启动抗体依赖性细胞吞噬作用刺激因子(GM_CSF)。由NK细胞分泌细胞因子刺激树突细胞成熟、NK细胞交互应答(cross_Fc区还结合巨噬细胞或浆细胞样树突状效应细胞上的Fc受体或结合C1补体复合物(C1q)的第一亚基，以分别启动细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性[0103]癌细胞过表达促进新血管快速生长的促血管生成因子。肿瘤周围的血管是异常仅在狭窄的暴露范围内有效(Kamba和[0104]神经纤毛蛋白1(NRP1)和神经纤毛蛋白2(NRP2)受体是分别在血管生成和淋巴管生成中具有重要作用的多功能单次跨膜糖蛋白。结合NRP1和NRP2的VEGF配体家族和Sema3配体中每一个的C端区域都结合NRP1和NRP2的b1结构域中的精氨酸结合口袋(Parker[0107]实体瘤周围的上皮屏障由致密填充有通过细胞间粘附因子连接的间质上皮细胞子E钙粘蛋白和整合素β1亚基的表达，其在许多实体瘤中过表达并增加细胞外基质连接，达在肿瘤相关内皮细胞和癌细胞中提高。NRP1表达通过提高Treg活性和降低肿瘤特异性[0110]抗NRP1抗体MNRP1685A(也称为维森库单抗)竞争性地与NRP1上的VEGF165结合，并重链可以与SEQIDNO:48_54的轻链配对。编码重链和轻链多肽的多核苷酸序列分别显示到对于具有SEQIDNO:41_47中所示的重链多肽序列和它们对应的SEQIDNO:48_54中所[0114]用单克隆抗体的NRP1结合结构域阻断VEGF与NRP1的结合可以抑开提供了稳健地抑制癌细胞系H1975中的细胞增殖的单克隆抗体NRP1结合结构域。具有对[0116]本公开提供了具有重链多肽序列的双特异性抗体，所述重链多肽序列包括N端EGFR结合结构域和C端NRP1结合结构域。双特异性抗体重链多肽包含包括可变重链(VH)和恒定重链1(CH1)的N端EGFR结合结构域，和包括恒定重链2(CH2)和恒定重链3(CH3)的Fc结[0118]ScFvNRP1结合结构域由通过柔性肽接头连接的可变重链和可变轻链组成。在一[0119]bsAb重链多肽序列显示在SEQID的轻链多肽序列，所述轻链多肽序列与重链多肽配对并显示在SEQIDNO:12中。编码SEQNO:69中显示的VH氨基酸序列和如SEQIDNO:70中显示的VL氨基酸序列(或由其组成)。在一些方面，双特异性抗体包含含有重链CDR1、CDR2和CDR3区的抗EGFR结合臂，所述重链CDR1、CDR2和CDR3区分别包含SEQIDNO:71、72和73中显示的氨基酸序列(或分别由其组有轻链CDR3区的抗EGFR结合臂，所述轻链CDR3区包含SEQIDNO:76中显示的氨基酸序列NO:77中显示的VH氨基酸序列和如SEQIDNO:78中显示的VL氨基酸序列(或由其组成)。在列(或由其组成)。在一些方面，双特异性抗体包含含有轻链CDR[0122]在一些实施方案中，双特异性抗体的EGFR结合结构域具有在亚纳摩尔范围(<亲和力(KD)范围为于对具有SEQIDNO:1的对照多肽序列的双特异性抗体构建体的70nM到[0123]本公开的一个方面提供了对EGFR和NRP1具有不对称结合[0124]用双特异性抗体的NRP1结合结构域阻断VEGF与NRP1的结合可以抑制VEGFR2的激有69.7nM的NRP1KD，不抑制VE发现NRP1结合结构域的解离常数(KD)不反映双特异性抗体抑制VEGFR2磷酸化的能力。例如，具有重链SEQIDNO:6的双特异性抗体在10130nM(IC50)下抑制50％的VEGFR2磷酸化，但NRP1KD为3.76nM，而具有重链SEQIDNO:4的双特异性抗体在410nM(IC50)下抑制50%NRP1结合结构域亲和力和生物学功能在抑制VEGFR2磷酸化方面是不成具有EGFR结合结构域和NRP1scFv结合结构域的双特异性抗体，其稳健地抑制癌细胞系[0129]在一些实施方案中，靶蛋白包含FGFR。在一些实施方案中，FGFR1选自FGFR1、[0131]在一些实施方案中，靶蛋白包含PDGFR。在一些实施方案中，PDGFR选自PDGFR、[0132]在一些实施方案中，靶蛋白包含VEGFR。在一些实施方案中，VEGFR选自VEGFR1、[0133]在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶选自EGFR/HER1/Erb1、HER2/ErbB2、HER3/有重链SEQIDNO:11和轻链SEQIDNO:12的双特异性抗体(在本文中也称为构建体11)显小鼠模型以抑制肿瘤生长的方法和结果。表4显示了抑制的肿瘤生长百分比，以及图12A_域与NRP1结合结构域组合以通过提高的EGFR亲和力促进向高EGFR表达肿瘤归巢的双特异渗和渗透。NRP1靶向进一步减少EGFR表面汇集以增强EGFR下调并抑制NRP1检查点免疫抑胞表面处的Fcγ受体(FcγR)被内吞并通过胞吞转运再循环回血清，这进一步增加了抗体FcRn或FcγR介导的再循环在维持抗体血清浓度中起重要作用。IgG1抗体具有比IgG2抗体体和腺相关病毒载体。重组载体可以通过操纵相关领域中常用的质粒(例如pSC101、核苷酸。在重组载体中编码的多核苷酸可以可操作地连接至启动子。如本文中使用的术语建为用于克隆的载体或用于表达的载体。作为用于表达的载体，可以使用相关领域中通常用于表达来自植物、动物或微生物的外源蛋白的载体。重组载体可以通过相关领域中已知此。或属于芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株诸如枯草芽孢杆菌(Bascillussubtilus)和苏云金沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和肠道菌群以及菌株诸如各种假单胞菌属(Pseudomonas[0149]本文中描述的多肽(bsAb和mAb)可以配制成药物组合物，其进一步包含可药用的E.W.Martin(MackPublishingCo.,Easton,Pa.,1980)公开了用于配制可药用的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本文中描述的多肽不相容，诸如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与可药用的组合物的任何其它组分相酸性的官能团时，可以通过使中性形式的此类多等，以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人,“Pharmaceutical[0155]优选通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体多肽来再生中性形式的多母体形式的多肽可以在某些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解度)方面不同于各种盐形[0157]在一些实施方案中，皮下制剂可以含有重组人PH20透明质酸酶(rHuPH20)以促进它常用的表面活性剂诸如吐温、司盘和其它乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目(诸如抗体蛋白)的其它药剂也可以包括在[0168]在另一方面，本公开提供了使用本公开的双特异性抗体抑制肿瘤细胞生长的方文中描述的bsAb可以与如本文中描述的另外的细胞毒性剂或治疗剂组合施[0170]在另一实施方案中，癌症与异常NRP1表达和/或功能(例如NRP1的过表达、突变[0172]在一个实施方案中，任选地与吉西他滨和/或顺铂组合的本公开的bsAb用于治疗[0173]在一个实施方案中，任选地与FOLFOX(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)或FOLFIRI(亚叶酸、氟尿嘧啶和依立替康)组合的本公开的bsAb用于治疗野生型RAS转移性结肠直肠癌(定义为KRAS和NRAS二者中的野生型，如通过FDA批准的用于该用途的测试所确定的那于治疗野生型RAS转移性结肠直肠癌(定义为KRAS和NRAS二者中的野生型，如通过FDA批准RAS突变型转移性结肠直肠癌或RAS突变状态未Inv(16)(p13.1q22),CBFB_MYH11的成人急性骨髓性白[0177]癌症可以是例如转移性或原发性癌症；结缔组织增生性或非结缔组织增生性癌在bsAb治疗之前测试患者肿瘤细胞上的目标生物标志物的表面表达(例如NRP1和/或EGFR的方法或药物组合物中实现，所述方法或药物组合物单独或与另外的合适的化学治疗剂(例如奥沙利铂、依立替康或FOLFOX)组合使用多肽或其可药用盐或溶剂化物(例如水合[0181]适用于与本文中描述的bsAb的组合疗法的抗癌剂包括但不限于手术、化学治疗氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2_乙基酰肼；丙卡巴肼；pske多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根霉素；西索菲兰(sizofuran)；螺锗粒制剂(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,111.)和TAXOTERE⑧多西他抗体或其抗原结合片段是派姆单抗或其抗原[0188]疗法组合(例如预防剂或治疗剂的组合)的协同效应可以允许使用较低剂量的一或治疗剂)和/或以较低频率施用所述疗法的能力可以降低与向受试者施用所述疗法相关免或减少与单独使用任一种疗法相关的不良或不想要的453(1981))、Loewe相加方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.PatholPharmacol.114:313_326(1926))和中值效应方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv抗体的重链多肽的多核苷酸序列的实例显示在SEQID轻链多核苷酸的多核苷酸序列显示在SEQIDNO:25(编码SEQIDNO:12的轻链多肽)中。SEQIDNO:26_38中所示序列公开了用于编码GGGGS肽接头亚基的多核苷酸序列(其氨基酸非翻译区中包括Kozak序列。度和大于98％的活力添加到CHO_S细胞中。将细胞培养物在具有19mm轨道的以125RPM摇振物增强(ExpiCHOTM增强剂；ThermoFisherScientificInc.)并补料(ExpiCHOTM补料；2下[0195]在AKTApure(GEHealthcareLifeSciences)上使用MabSelectprismATM树脂(GEHealthcareLifeSciences)纯化所有抗体灭菌上清液。使用50mM磷酸钠，150mMNaCl，pH7.0缓冲液来平衡树脂。随后将抗体上清液装载到柱中。用50mM磷酸钠，150mM[0196]使用阳离子交换色谱纯化抗体。将阳离子交换色谱柱(CaptoSImpAct)用1M(洗脱缓冲液)进行平衡。以1_2g抗体/mL树脂的浓度装载蛋白A纯化的抗体。随后用50mM[0197]在具有二极管阵列UV检测器WR的AgilentInfinity1260II四元泵高效液相色谱(HPLC)系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。将二十(20)μg抗体材料注入到aXBridge[0198]使用OctetRed96系统进行BLI结合研究以评估双特异性抗体与重组huEGFR和huNRP1的结合。简而言之，将商业来源的生物素化huEGFR和huNRP1固定化在链霉亲和素瘤相关必需受体靶向抗体(TARE_TAB)是否结合癌症靶标(EGFR和NRP1)并评估它们对靶标[0199]将huEGFR和huNRP1(在它们各自的固定化柱中)在2x动力学缓冲液中以0.2μg/ml构建体的解离。通过在空白AMC生物传感器或链霉亲和素生物传感器表面上施加构建体来SEQIDNO:1以两位数纳摩尔亲和力结合NRP_1。图1A_1K显示双特异性抗体对固定化[0201]通过在蛋白印迹上用抗磷酸化VEGFR2探测经电泳的细胞裂解物，测试HUVEC细胞bsAb处理30分钟，所述bsAb用无血清培养基从1μM的最高浓与100μL含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的NP_40裂解缓冲液一起温育20分钟来制备细胞裂解[0202]将等于10μg的细胞裂解物与4μl的PageRulerPlus预染蛋白ladder一起装载到4_印系统转移至膜。将膜用1xTBST中的5％乳在室温下封闭1小时，并与抗磷酸化VEGFR2(Y1175)一起在1xTBST中的5％乳中在4℃下温育整夜。第二天，将膜三次用TBST洗涤10分膜与SuperSignalFemto化学发光底物一起温育1_2分钟，并用AmershamImageQuant800[0203]使用ImageJ软件分析磷酸化VEGFR2(Y1175)和VEGFR2的蛋白印迹条带的强度。通解物(阳性对照)的比率计算bsAb对VEGFR2磷酸化的抑制。使用Prism9软件确定bsAb对VEGFR2磷酸化的IC50。图3中的蛋白印迹显示，与SEQIDNO:1的双特异性抗体一起温育HUVEC细胞不会抑制VEGF165介导的VEGFR磷酸化。图4_10显示了与双特异性抗体一起温育表2.VEGFR信号传导抑制的双特异性细胞在补充有1％青霉素/链霉素和10％FBS的RPMI1640中生长。将细胞用胰蛋白酶消化并铺板到具有圆底的96孔3D培养板(3,000个细胞/120μl/孔)中并温育3_4小时直到它们聚集形成3D球状体。制备从5μM至0.6μM6倍连续稀释的bsAb的储备母板。用30μL的bsAb处理[0206]测试H1975细胞系异种移植小鼠模型中bsAb抑制肿瘤生长的能力。所有细胞系均获自美国典型培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(Manassas,VA,USA)。将细胞在含有10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT,USA)和2mmol/L谷氨酰胺(HyClone,Logan,UT,USA)的RPMI1640(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中在37℃下在5％CO2培养箱中维[0207]涉及小鼠的实验和程序根据美国农业部卫生与人力资源服务部(U.S.DepartmentofAgriculture,DepartmentofHealthandHumanServices)以及关于实验室动物的人×107个(NCI_H1975)细胞。对于效力研究，在随机化和开始治疗之前，使肿瘤达到150至化当天以指定的剂量水平用每次治疗每只小鼠100μL的总体积i.p.注射，[0210]使用GraphPadPrism7软件(LaJolla,C时对照组和治疗组中的平均肿瘤体积，且Vc0和Vt0是实验开始时对照组和治疗组中的平均[0211]表4显示了异种移植小鼠模型中bsAb肿瘤生长抑制和治疗/对照的肿瘤体积百分比。图12A_12F中的曲线显示了用bsAb治疗的小鼠中植入后数天内的平均肿瘤体积。具有scFvNRP1结合结构域的bsAb具有最高的肿瘤生长抑制，例如用具有重链SEQIDNO:11的39.9423.9471.13和包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链构成。该双特[0214]在该实施例中，测试与单独的抗NRP1或抗EGFR或组合的两种mAb相比，构建体样)，而抗EGFRmAb(单独或与抗NRP1组合)和构建体11均能够在处理5分钟内完全内化60和61(其分别编码SEQIDNO:41_47)中。编码与单克隆抗体的重链组合的轻链多肽的多列。度和大于98％的活力添加到CHO_S细胞中。将细胞培养物在具有19mm轨道的以125RPM摇振物增强(ExpiCHOTM增强剂；ThermoFisherScientificInc.)并补料(ExpiCHOTM补料；2下[0221]在(GEHealthcareLifeSciences)上使用MabSelectprismATM树脂(GEHealthcareLifeSciences)纯化所有抗体灭菌上清液。使用50mM磷酸钠，150mMNaCl，pH7.0缓冲液来平衡树脂。随后将抗体上清液装载到柱中。用50mM磷酸钠，150mM[0222]使用阳离子交换色谱纯化抗体。将阳离子交换色谱柱(CaptoSImpAct)用1M(洗脱缓冲液)进行平衡。以1_2g抗体/mL树脂的浓度装载蛋白A纯化的抗体。随后用50mM[0223]在具有二极管阵列UV检测器WR的AgilentInfinity1260II四元泵高效液相色谱(HPLC)系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。将二十(20)μg抗体材料注入到aXBridge时申请号63/325,317(其全部内容通过引用明确并入本文)的实施例中所述评估结合亲和