CN119404102A 用于基于悬浮的磁分离的方法和系统 （力微拓公司）

2024.06.12PCT/US2022/0462192022.10.11WO2023/064237EN2023.04.20描述了用于基于磁悬浮分离包括各种类型剂盒的一些实施方式可用于基于磁悬浮分离包方式可用于基于磁悬浮分离细胞的混合物或群2其中所述磁性剂包含磁性微粒和优先与所述多种细胞类型的靶类型的细胞的连接剂b)在顺磁性流体介质中形成悬浮液，所述悬浮液包d)将所述处理通道暴露于磁场中一段时间，所述一合物中的至少一些迁移到所述处理通道的一侧或多侧并固定到所述处理通道的一侧或多2.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接剂包含能够特异性结合至所述靶类型的将所述抗体或所述抗体的结构域结合至所述靶类型的所述细胞表面上的所述部分；将所述抗体或所述抗体的所述结构域结合至所4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述连接剂f)停止将所述处理通道暴露于所述磁场，从而释放所述固g)从所述流动池筒中取出至少部分具有所述7.根据权利要求5或6所述的方法，其中步骤(e)8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(d)在所述流动池筒的停止流动9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(e)3a)将第一悬浮高度改变剂结合至包含多种细胞类型的细胞群中所述第一悬浮高度改变剂包含第一顺磁性或超顺磁性微粒和优先结合至所述第一类型b)在顺磁性流体介质中形成悬浮液，所述悬浮液包d)将所述处理通道暴露于磁场中第一时间段，一复合物在所述处理通道中与未结合所述第一悬浮高度改变剂的所述多种细胞类型的细15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一类型的所述细胞选自由以下所组成的16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述第一复合物在所述流动池筒的所述处理通道中悬浮得低于所述未结合所述第一悬浮高度改变剂的所述多种细17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述第一连接剂包含能够特异性18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一部分选自由以下所组成的组：CD45、能够特异性结合至所述第一类型的所述细胞表面上的所述第一部分的所述第一抗体所述第一抗体或所述第一抗体的所述结构域与所述第一顺磁性或超顺磁性微粒的结20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第一连接剂通过一种或多种共价或非共价相互作用结合至所述第一顺磁性e)从所述流动池筒中取出所述第一部分的至少一部分和/或取出所述第二部分的至少4f)从所述流动池筒中取出所述第一部分的至少一部分和/或取出所述第二部分的至少23.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(e)通过所述流动池筒的第一出口通道执在步骤(a)中，将第二悬浮高度改变剂结合至包含多种细胞类型的所述细胞群中的第至所述多种细胞类型的所述第二类型的细胞的第其中所述第二悬浮高度改变剂的结合是在所述第二悬浮高度改变剂结合所述第二类至少一些所述第二复合物在所述处理通道中与未结合所述第二悬浮高度改变剂的所述多种细胞类型的细胞，与所述第一复合物以及与所述多种细胞类型的其它类型的细胞分离，25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第二连接剂包含能够特异性结合至所述第二类型的所述细胞表面上的第二部分的第二抗体或所述第二能够特异性结合至所述第二类型的所述细胞表面上的所述第二部分的所述第二抗体所述第二抗体或所述第二抗体的结构域与所述第二微27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述第二连接剂通过一种或多种共价或非共价相互作用结合至所述第二顺磁性28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述第一连接剂或所述第二连接29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述第一时间段与所述第二时间f)从所述处理通道和/或所述流动池筒中取出所述第三部分的至少一部分或取出所述31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(f)通过所述流动池筒的第二出口通道执32.根据权利要求14至31中任一项所述的方法533.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中步骤(e)和(f)包括使所述悬浮液35.根据权利要求14至34中任一项所述的方法，其中所述流动池筒在所述磁场中的垂36.根据权利要求14至35中任一项所述的方法，其中所述第一顺磁性或超顺磁性微粒39.根据权利要求14至38中任一项所述的方法，其中所述第一顺磁性或超顺磁性微粒41.根据权利要求14至40中任一项所述的方法，其中一个或多个所述第一类型的细胞42.根据权利要求14至40中任一项所述的方法，其中所述第一复合物中的一个或多个所述第一类型的细胞和/或所述第二复合物中的一个或多个所述第二类型的细胞是活细其中每种悬浮高度改变剂包含顺磁性或超顺磁性微粒，以45.根据权利要求43或44所述的试剂盒，其中所述连接剂共价结合至所述顺磁性或超46.根据权利要求43或44所述的试剂盒法，其中所述试剂盒包含一种或多种类型的所述顺磁性或超顺磁性微粒和一种或多种类型的所述连接剂作为所述一种或多种所述悬浮其中所述一种或多种类型的所述顺磁性或超顺磁性微粒用能够介导与所述一种或多种类型的所述连接剂非共价相互作用的部分47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述非共价相互作用包括以下中的一种或多述抗体结合蛋白的结构域与其结合配偶体之间的相互作649.根据权利要求48所述的试剂盒，其中优先结合至所述细胞表面标记的连接剂选自51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述磁性微粒包括金属、金属氧化物或金属52.根据权利要求48至51中任一项所述的试剂盒，其中所述连接剂共价结合至所述磁53.根据权利要求48至51中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种类型的所述磁性微粒和一种或多种类型的所述连接剂作为所述一种或多种所述磁性剂的单其中所述一种或多种类型的所述磁性微粒用能够介导与所述一种或多种类型的所述54.根据权利要求52所述的试剂盒，其中所述非共价相互作用包括以下中的一种或多述抗体结合蛋白的结构域与其结合配偶体之间的相互作55.根据权利要求42至53中任一项所述的试剂盒，其中所述连接剂是能够特异性结合至所述靶细胞类型表面上的部分的抗体或所磁性微粒，其能够单独或与其它试剂组合，优先结合至包含多种细胞类站，包括用于所述流动池筒的保持块和一个或多个磁体将位于所述保持块中的所述流动池筒的所述处理其中将包含顺磁性流体介质中的所述多种细胞类型的细胞的悬浮液的所述流动池筒其中所述第一复合物在所述流动池筒的所述处理通道中悬浮57.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述其它试剂包括优先结合至所述第一类型58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述磁性微粒用能够介导与所述连接剂非共760.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述磁性微粒包括金属、金属氧化物或金属8[0001]本申请要求于2022年4月7日提交的美国专利申请号63/362,627以及于2021年10[0002]磁悬浮最近成为一种分离粒子(包括细胞和生物分子)的有用方法。在磁悬浮期levitationofsinglecells)”，ProcNatlAcadSciUSA112(28):E3661_8第一时间段足以使至少一些所述第一复合物在所述处理通道中未与所述第一悬浮高度改9[0005]在本发明的实施方式中还包括用于磁悬浮的试剂盒，并在本公开中进行了描多个磁体定位成将位于所述保持块中的所述流动池筒的所述处理通道暴露于磁场中，其所述第一复合物在所述流动池筒的所述处理通道中悬浮得低于未在磁性粒子中复合的所[0010]图5是根据本公开描述的一些实施方式示出与磁性微珠复合的细胞的分离的摄影[0011]图6是根据本发明的示例性实施方式示出抗体表面覆盖率对细胞分离的影响的点微粒的复合物(每个复合物包括一个具有与浮高度。这些参数中的一些是包含在顺磁性或超顺磁细胞或其他粒子)混合群。然后可以从处理通道中取出耗尽了感兴趣的分析物的顺磁性流分子或分子复合物的混合物或群，如分离核酸，例如在下一代测序(NGS)期间分离核酸文磁悬浮分离混合物或分离已被内吞磁性粒子吸收的细胞和/或附图提供的描述来进一步阐明和理解。一些其它术语可以在本文件的其它部分和附图中明确地或隐含地定义，并且可以基于本发明领域中的公认惯例以及整个本文件和/或和技术是众所周知且常用的除非另有说明已知的方法和技术通常根据众所周知的常规质或精度的测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值或值范围的20％、加磁场的情况下，顺磁性材料不会保持任何磁性。参见，例如，Britannica，百科全书参见PedroM.Enriquez_Navas和MariaL.Garcia_MartinNanoparticlesforDiagnosisBasedonMRI”FrontiersofNanoscience4:233_245胞)结合的连接剂。悬浮高度改变剂借助连接剂同[0037]悬浮高度改变剂在特定条件下改变与其形成复合物的粒子的悬浮高度的固有特数影响用特定剂标记的细胞(或其它粒子)在基于磁悬浮的分离过μm、约100μm至约0.0005μm(0.5nm)、约1(100nm)、约100μm至约0.25μm(250nm)、约100μm至约0.5μm(500nm)、约100μm至约1μm(500nm)至约0.001μm(1nm)、约0.5μm(500nm)至约0.01μm(10nm)、约0.5μm(500nm)至约0.025μm(25nm)、约0.25μm(250nm)至约0.05μm(50nm)、约0.25μm(250nm)至约0.1μm约0.05μm(5nm)、约0.05μm(5nm)至约0.0005μm(0.5nm)、约0.05μm(50nm)至约0.001μm种或多种制成或包含这些中的一种或多种)的微粒。在本发明的实施方式中使用的磁性微括具有不同悬浮高度改变和/或磁性特性的多种(两种或更多种)类型的微粒。在一些示例接，而不同(第二)类型的磁性微粒可以与用于标记第二剂)的悬浮高度改变剂将与具有相同悬浮改变或磁性质[0043]悬浮高度改变剂或磁性剂与细胞或其他物体的结合以及在磁悬浮过程中所得复在上述计算中，细胞周围的壳体积乘以球形填充因子(随机排列的相等的球体)[0045]将细胞周围可容纳的微粒的最大数量确定为上限，可以为各种尺寸的珠确定微使用的微粒的密度被指定为1.18g/cm3。计算中使用的细胞的密度为1.063g/cm3，直径为的微粒覆盖率的复合物。用浅灰色突出显示的表格单元格表示细胞表面约有80％至100%于3μm的微粒不会形成密度高于所选截止值的复合物，因为这需要微粒对细胞表面的覆盖形成过程中需要较高的微粒与细胞的比率(本公开中[0047]生产磁性微粒的一些方法描述于，例如，Lu等人，“ModularandIntegratedSystemsforNanoparticleandMicroparticleSynthesis—AReview”BiosensorsBiosciences(加利福尼亚州圣何塞；例如,BDTMIMagnanoparticles)、ThermoFisherUSA)、MiltenyiBiotec(德国北莱茵_威斯特法伦州贝尔吉施格拉德巴赫；例如,MAc酸)。连接剂与细胞或其他分析物特异性结合。连接剂可以包括一种或多种特异性结合分酸与其它寡聚核苷酸或多核苷酸的结合、寡聚核苷酸或多核苷酸与蛋白质或多肽的结合工程化的和天然存在的核酸或肽适配体都可以作为特异性结合分子。该列表不是限制性合物和抗体的生物素部分之间的中间结合相互作用允许在靶细胞和密度调节微粒之间形或抗抗体与一抗之间的中间结合相互作用允许在靶细胞和磁性微粒之间控可以在其中流动的流体装置上的路径。通道包括的路径最大高度尺寸为：约100mM、约且不影响细胞的生存力或影响细胞行为。顺磁性材料可以包括以下中的一种或多种：钆、[HoCl6]、[BMIM][FeCl4]、[BMIM]2[[FeCl4[0059]例如，在Durmus等人和2021年9月29日提交的美国专利申请号17/449,438中描述[0060]根据本发明的实施方式的至少一些方法和试剂盒涉及用于磁悬浮系统的流动池筒。在图2中示意性地示出了一种示例性流动池筒。一种示例性流动池筒可以包括平面基聚合物(COP)或环烯烃共聚物(COC))是合适的光学透明材料的一些示例。平面基板的尺寸[0063]示例性的基于磁悬浮的分离系统(如图1所示)包括用于保持流动池筒的接收块；动池筒放置成与光学系统光学对准，可拆卸地与流动池筒的处理通道附近的磁性部件啮[0064]接收块的一个可选特征是与流动池筒顶部或底部上的出口连接的一系列流量调[0065]磁悬浮系统能够使悬浮在顺磁性流体介质中的粒子在流动池筒的处理通道或入或约10兆高斯奥斯特至约100兆高斯奥斯特。磁体的表面场强范围可以为约0.01特斯拉至周围，并且前部上磁体和后部下磁体以磁排斥方向定位。示例性的NdFeB磁性部件尺寸包x3mM和25x15x2mM。磁悬浮系统的示例性磁体构造包括尺寸为约75x20x3.2mM的上磁代地，可以用相同的悬浮高度改变和/或磁性剂来标记两种或更多种不同的细胞类型。例具有相同悬浮高度改变特性的不同悬浮高度改变剂来标记两种或更多种不胞类型上的标记的数量将确定有多少单位的悬浮高度改变和/或磁性剂可以与该细胞结列出的其它参数，并且PTC比率可通过实验确定和/或针对特定标记和/或分离应用进行优细胞混合物之前，可以将对每种细胞类型具有不同特异性连接剂的磁性微粒混合在一起，ofseparatingcells或methodsofcellisolation或cellisolationmethods或methodsofisolatingcells或cellsegregationmethods或methodsofsegregatingcells)”、“细胞浓缩方法(cellconcentrationmethods或methodsofconcentrating[0072]本公开中描述的方法可用于从包括多种细胞类型的细胞群中分离一种或多种类[0073]根据本发明的一些实施方式的细胞分离方法涉及将一种或多种悬浮高度改变和/或磁性剂结合到在包含多种细胞类型的细胞群可以具有不同的表面标记。本发明的细胞分离方法的胞分离方法的实施方式可以利用能够与含有多种细胞类型的细胞群中的不同靶细胞类型[0074]在涉及悬浮高度改变和/或磁性剂与一种或多种特定类型的细胞结合的细胞分离括与悬浮高度改变和/或磁性剂与细胞结合相关的任何步骤。可以在方法开始之前形成悬浮高度改变和/或磁性剂与靶细胞的复合物，并且可以在根据本发明的实施方式的细胞分[0075]根据本发明的细胞分离方法的一些实施方式包括在顺磁性流体介质中形成一种或多种悬浮高度改变和/或磁性剂和靶细胞类型的细胞以及多种细胞类型的多个细胞的复根据本发明实施方式的细胞分离方法涉及将悬浮液引入磁悬浮系统的流动池筒的处理通多种悬浮高度改变和/或磁性剂的至少一些复合物(或至少一种复合物)和靶细胞类型的细可能影响一种或多种悬浮高度改变剂和靶细胞类型的复合物(或至少一种复合物)相对于[0077]在利用具有不同悬浮改变特性的多个悬浮高度改变和/或磁性剂的细胞分离方法的实施方式中，所述悬浮高度改变和/或磁性剂能够与含有多种细胞类型的细胞群中的不[0078]根据本发明的实施方式的细胞分离方法还可以包括从流动池筒的处理通道中或是使用具有悬浮改变特性的磁性微粒进行细性或超顺磁性的)包含在悬浮高度改变剂(4)中，该悬浮高度改变剂能够与第一细胞类型变剂允许分离富含复合物(3)或耗尽复合物的样品的部分，从而允许从包含多种细胞类型型(1)和第二类型(2)，它们具有不同的表面标记(改变剂(4)包含与抗体缀合的顺磁性或超顺磁性微粒，所述抗体能够与两种细胞类型的第的实施方式使用磁性微粒来耗尽含有至少两种细胞类型的细胞群，第一类型(1)和第二类在从流动池筒中取出耗尽第一类型复合物的部分之后，可以停止将处理通道暴露于磁场，一类型的复合物的悬浮液。然后可以从流动池筒中取出富含第一类型的复合物的悬浮液，改变剂和/或磁性剂(如本公开中其他地方详细描述的)，或一种或多种类型的悬浮高度改形成复合物。每种悬浮高度改变剂或磁性剂包含磁性微粒和优先结合靶细胞类型的连接性纳米珠(300nm直径)得自Spherotech(伊利诺斯州森林湖,USA)。CD45抗人抗体与微珠结M游离生物素混合。然后将所得混合物与35μL超顺磁性纳米珠混合，并在室温下温育30分152,Jurkat克隆E6.1)的Jurkat细胞用最终浓度为10μM的CalceinAM(ThermoFisherCultureFacility,加利福尼亚州伯克利)用最终浓度为10μM的CellTrackerRedCMPTX涤3次，以除去过量的荧光染色。将染色的Jurkat和H358细胞混合至约50％H358细胞/约ratio)为50,000:1，这意味着将约25x109个结合有抗人类CD45生物素化抗体的纳米珠加[0086]图5示出了对照实验(左图)的流动池中平衡阶段结束时的细胞混合物的和具有磁细胞(用绿色荧光钙黄绿素AM染料标记)和CD45_H358细胞(用红色荧光Jurkat细胞(绿色荧光)不再悬浮，因为与细胞结合的磁性粒子已经将细胞从溶液中拉出[0087]使用磁性微珠分离Jurkat细胞的方法基本上按照实施例1中所述的方法进行，但类CD45抗体标记15％CD45neg/85％CD45pos细胞的混合物，以结合细胞表面上所有可用的抗体_CD45相互作用(KD为约10_6至10_9mol/L)的亲和力较低，因此需要近10倍的超顺磁性粒的尺寸必须足够小以达到溶液中的饱和浓度，并且足够大以包含足够的磁性材料(如的密度以实现其悬浮高度。微粒尺寸对细