TZNX-辅酶NADP+水溶液中NADP+检测方法 高效液相色谱法编制说明

PAGE1PAGE6辅酶NADP+水溶液中NADP+检测方法高效液相色谱法团体标准编制说明(审查稿)浙江新安化工集团股份有限公司二0二六年七月

辅酶NADP+水溶液中NADP+检测方法高效液相色谱法团体标准编制说明工作简况1.1任务来源根据浙江省农药工业协会下达的关于征集第十批团体标准立项建议的通知（浙化农协字[2026]xx号），由浙江新安化工集团股份有限公司负责“辅酶NADP+水溶液中NADP+检测方法高效液相色谱法”团体标准的制定工作。1.2标准起草单位本标准的起草单位为浙江新安化工集团股份有限公司。1.3标准制定过程2026年3月，起草单位编制提交立项申请书，省农药协会在全国团标信息平台立项公示；2026年4-6月，标准完成立项，起草单位进行了标准分析方法的研究与验证工作；2026年7月，起草单位提出标准征求意见稿，省农药协会组织专家进行了标准预审。标准编制原则和标准主要内容2.1标准编制原则标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际接轨，注重标准的通用性、适用性、配套性和可操作性。确保标准既保持技术上的先进性，又具有经济上的合理性。标准制定过程中严格遵守国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。与同体系标准和相关的各种基础标准以及配套使用的基础标准等相关标准相衔接，遵循政策和协调统一性原则。本标准制定过程中严格按照GB/T1.1-2020的规定编写，力求做到技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。2.2标准编制的依据根据《中华人民共和国标准化法》和《团体标准管理规定》的有关规定，本标准确定了试验方法。其中依据的国家标准和行业标准有：GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170－2008数值修约规则与极限数值的表示和判定2.3制定本标准的目的和意义精草铵膦作为传统草铵膦的升级替代品，其生物活性倍增，可实现用量减半，高度契合国家农药减量增效的政策导向，市场潜力巨大。在生物法合成精草铵膦的产业化进程中，氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）扮演着能量供给者和物质基础的双重关键角色。精草铵膦生物法合成的核心步骤，是在谷氨酸脱氢酶（GDH）的催化下，将前体物质2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸（PPO）通过不对称还原胺化反应，转化为具有光学活性的L-草铵膦。这个反应的关键在于，GDH是一种NADPH依赖性酶，必须以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为还原剂和氢供体才能工作。直接向反应体系添加昂贵的NADPH不经济，构建高效的NADP+/NADPH再生系统是提高产量的关键。建立水溶液中氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）的检测方法，是开展涉及辅酶NADP(H)相关研究和生产的基础。其根本目的在于实现对NADP+的精准定性和定量，评估辅酶再生系统的运行状态，实现对生产成本的精细化管控。新安研究团队长期深耕于生物发酵与L-草铵膦合成领域，已取得阶段性重要成果：自主开发的氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）成功应用于精草铵膦合成，并实现产业化落地。为保障氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）产品质量稳定、持续满足下游客户需求，并进一步强化对产品质量的系统化监督与管理，当前亟需建立一套稳定可靠、经过全面验证的检测方法，为产品质量的一致性与产业化工艺的稳健运行提供坚实保障。2.4适用范围和主要内容本标准适用于辅酶NADP+水溶液中NADP+含量的测定，精草铵膦合成用辅酶NADP+水溶液中NADP+含量范围在5%～20%。主要内容为以下：说明了方法的适用范围和检测原理；规定了取样和储存要求；规定了测定所需的仪器设备及相关材料；规定了所用试剂、相关溶液及标准溶液的配制过程；规定了样品处理操作过程；规定了液相色谱的操作条件；规定了测定及计算过程；规定了允许差的要求。分析方法的说明试样用磷酸二氢钠溶液溶解，以甲醇+磷酸二氢钠溶液为流动相，使用以C18为填料的不锈钢柱和紫外检测器（260nm），对辅酶NADP+进行高效液相色谱分离和测定，外标法定量。方法验证线性试验准确称取NADP+标样0.04088g（精确至0.00001g）置于50mL容量瓶中（已知标样质量分数为98.0%），用磷酸二氢钠溶液溶解并定容。分别移取3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL上述溶液于5个10mL容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液稀释并定容，摇匀。按照相同的液相色谱条件进行分析，测定不同标样浓度下所获得的峰面积，以NADP+质量浓度为横坐标，标样溶液中有效成分峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1，图1。表1NADP+线性关系测定结果编号12345NADP+质量浓度（μg/mL）240.37320.50400.62480.75560.87峰面积（mAu*s）3656.84918.46124.57338.98571.13664.14917.46136.57332.38567.3峰面积平均值（mAu*s）3660.44917.96130.57335.68569.2图1NADP+标准曲线图线性方程为：y=15.2703x+5.1156相关系数R²=0.9999从表1和图1可以看出在上述液相色谱操作条件下，当NADP+质量浓度在(240.37～560.87)μg/mL之间，有良好的线性关系，完全可以满足定量分析要求。线性关系试验典型谱图见附图1～附图5。精密度试验标样溶液的制备准确称取NADP+标样0.04088g（精确至0.00001g）置于50mL容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液溶解并定容。移取上述溶液5.0mL于10mL容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液定容，摇匀。样品溶液的制备分别称取同一样品五份于50mL容量瓶中，称样量分别为0.18633g、0.18242g、0.17045g、0.20542g、0.19154g，用磷酸二氢钠溶液溶解并定容，摇匀，经0.45μm滤膜过滤。按照相同的液相色谱条件进行分析，测定含量，结果见表2。表2精密度试验编号12345标样称样量（g）0.040880.040880.040880.040880.04088标样溶液峰面积-1（mAu*s）6123.56132.66117.26143.06133.8标样溶液峰面积-2（mAu*s）6132.66117.26143.06133.86114.2标样溶液平均峰面积（mAu*s）6128.06124.96130.16138.46124.0样品称样量（g）0.186330.182420.170450.205420.19154样品溶液峰面积-1（mAu*s）5748.55663.45322.56381.55916.6样品溶液峰面积-2（mAu*s）5772.55659.35316.06366.85920.6样品溶液平均峰面积（mAu*s）5760.55661.45319.26374.25918.6质量分数（%）10.1110.1510.2010.1310.11质量分数平均值（%）10.14极差（%）0.09标准偏差（%）0.037变异系数（%）0.36表2可见，该方法的极差为0.09%，变异系数为0.36%，对NADP+质量分数的测定有良好的精密度。典型谱图见附图6～附图11。准确度试验标样溶液的制备准确称取NADP+标样0.04088g（精确至0.00001g）置于50mL容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液溶解并定容。移取上述溶液5.0mL于10mL容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液定容，摇匀。样品溶液的制备准确称取0.09012gNADP+样品于50mL容量瓶中，加入0.01034gNADP+标样，用磷酸二氢钠溶液溶解并定容，摇匀，经0.45μm滤膜过滤。按照上述方法再制备4个样品溶液。按照相同的液相色谱条件进行分析，测定NADP+含量，将上述所测得值与理论值比较，求出回收率，结果见表3。表3准确度试验处理编号12345标样称样量（g）0.04088标样溶液峰面积-1（mAu*s）6113.76103.26098.96108.26115.6标样溶液峰面积-2（mAu*s）6103.26098.96108.26115.66119.2标样溶液峰面积平均值（mAu*s）6108.46101.06103.66111.96117.4样品质量（g）0.090120.097470.093930.097140.09026样品中NADP+理论值（g）0.0091380.0098830.0095240.0098500.009152加标质量（g）0.010640.010370.009650.010070.01137标样中NADP+理论值（g）0.010430.010160.009460.009870.01114样品溶液峰面积-1（mAu*s）5959.76069.25745.46026.36172.9样品溶液峰面积-2（mAu*s）5947.26059.95761.16051.06194.6样品溶液峰面积平均值（mAu*s）5953.46064.65753.26038.66183.8实测NADP+总质量（g）0.019520.019910.018880.019790.02025实测NADP+加标质量（g）0.010380.010030.009360.009940.01110回收率X1（%）99.5298.7298.94100.7199.64平均回收率（%）99.51由表3可见，该方法中NADP+平均回收率为99.51%，具有良好的准确度。准确度试验原始谱图见附图12～附图17。特异性试验本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别NADP+。对标样和样品进行HPLC-DAD检测，从全波长扫描谱图中得出在260nm有较大吸收波长；标样和样品中NADP+色谱峰纯度因子分别为997.278、999.701（＞990），符合定性要求，典型谱图见附图18、附图19。标准水平评价本标准有效成分含量的检验方法采用高效液相色谱法，方法具有较宽的线性范围和较好的精密度和准确度，方法简便、快捷，适用于工业控制分析。本标准与现行相关法律、法规、规章及相关标准的协调性与现有标准、制定中标准是协调配套的，没有与其他行业、领域交叉、不协调的情况。本文件在标准体系中的位置该项目目前没有其他的行业（国家）标准，处在农药标准体系表中第四层位置。涉及国内外专利的情况报批项目不涉及国内外专利与知识产权问题。附图附图1标准曲线图附图2标准曲线图附图3标准曲