中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识

中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识一、前言感染性疾病是临床常见的多发病，也是导致全球人类死亡的重要原因之一。随着免疫抑制剂使用增加、器官移植普及、肿瘤放化疗推广以及抗菌药物广泛应用，疑难危重感染、免疫缺陷患者感染及新发突发传染病的发病率逐年上升，传统病原体检测技术（如培养、血清学、PCR等）存在检测周期长、阳性率低、覆盖范围有限等局限性，难以满足临床快速精准诊断的需求。宏基因组学第二代测序技术（metagenomicnext-generationsequencing,mNGS）无需预先培养病原体，可直接对临床样本中所有核酸进行测序，通过生物信息分析识别病原体，具有覆盖范围广、检测速度快、灵敏度高等优势，已成为感染性疾病诊断的重要技术手段。为规范mNGS在临床感染病原体检测中的应用，提高检测质量与临床诊疗水平，由国内感染病学、临床检验学、微生物学等多领域专家共同制定本共识，为临床医师、检验人员及相关技术人员提供参考。二、适用范围（一）推荐应用场景疑难危重感染患者：经常规病原体检测（培养、血清学、靶向PCR等）阴性或无法明确病原体，且病情进展迅速或治疗效果不佳者，包括不明原因发热、脓毒症、感染性休克等。免疫功能低下患者感染：如艾滋病患者、接受器官移植或造血干细胞移植患者、长期使用免疫抑制剂或糖皮质激素患者、肿瘤放化疗后粒细胞缺乏患者等，此类患者感染病原体复杂，常规检测阳性率低，mNGS可快速明确病原体。中枢神经系统感染：如脑膜炎、脑炎、脑脓肿等，常规脑脊液检测（培养、生化、涂片）阳性率低，mNGS可有效检测病毒、细菌、真菌、寄生虫等多种病原体。新发突发传染病应急检测：当出现不明原因聚集性感染或新发传染病疫情时，mNGS可快速识别未知病原体，为疫情防控提供依据。特殊部位感染：如骨关节感染、腹腔感染、眼部感染等，样本获取困难或常规检测阳性率低的感染。（二）不推荐/谨慎应用场景已通过常规检测明确病原体，且临床治疗方案有效，无需进一步明确病原体者。样本质量不合格：如样本采集不规范、运输保存不当导致核酸降解，或样本中宿主核酸占比极高（如血清样本无细胞成分）且未进行有效宿主核酸去除处理者。仅需检测特定已知病原体，且靶向PCR等技术可满足需求者，mNGS成本较高，不优先推荐。三、临床检测流程规范（一）样本采集与运输样本类型选择：根据感染部位优先选择最可能含病原体的样本，如呼吸系统感染优先选择支气管肺泡灌洗液（BALF），其次为合格痰液；中枢神经系统感染选择脑脊液；血流感染选择EDTA抗凝全血或血浆；腹腔感染选择腹水或腹腔引流液；组织感染选择病变组织样本。采集规范：严格遵循无菌操作原则，避免样本污染。血液样本采集应在抗菌药物使用前或停药后至少48小时采集，每次采集2-3套血培养瓶（需氧+厌氧）同时留取mNGS检测样本；脑脊液采集量应≥2ml，避免凝固；BALF采集量≥10ml，离心后取沉淀送检；痰液需进行合格性评估（鳞状上皮细胞<10个/低倍视野，中性粒细胞>25个/低倍视野）。运输与保存：样本采集后应立即送检，常温运输时间不超过2小时；若无法立即送检，应置于-20℃冰箱保存，保存时间不超过72小时，长期保存需置于-80℃冰箱，避免反复冻融。（二）样本处理核酸提取：选择具有较高提取效率的核酸提取试剂盒，针对不同样本类型优化提取方法。对于宿主核酸占比高的样本（如脑脊液、血液），可采用宿主核酸去除技术（如磁珠法、酶解法）提高病原体核酸的检出率。核酸质量评估：采用Qubit荧光定量法检测核酸浓度，琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测核酸完整性，确保核酸浓度≥1ng/μl，完整性良好（无明显降解）。（三）文库构建与测序文库构建：选择合适的文库构建试剂盒，根据样本核酸类型（DNA/RNA）选择对应的文库构建流程。对于疑似病毒感染的样本，需同时进行DNA和RNA文库构建。文库构建过程中需设置阴性质控品（如无核酸水）和阳性质控品（如已知浓度的病原体核酸），以监控文库构建过程中的污染和效率。测序平台与深度：优先选择Illumina、IonTorrent等主流第二代测序平台。根据样本类型和检测目的确定测序深度：血液、脑脊液等宿主核酸占比高的样本，测序深度应≥10G；痰液、BALF等样本测序深度≥5G；组织样本测序深度≥2G。对于疑似低丰度病原体感染的样本，可适当提高测序深度。（四）生物信息分析数据预处理：对下机原始数据进行质量控制，去除接头序列、低质量reads（Q值<20）、短reads（长度<50bp），得到干净数据（cleanreads）。宿主序列去除：将cleanreads与人类参考基因组（如hg38）进行比对，去除比对上的宿主序列，保留非宿主序列用于病原体分析。病原体比对与注释：将非宿主序列与病原体数据库（包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等）进行比对，常用数据库包括NCBIRefSeq、GenBank、ClinVar等。选择合适的比对算法（如BWA、Bowtie2），设置合理的比对阈值（如比对相似度≥95%，覆盖度≥10%）。结果筛选与报告：根据测序深度、比对reads数、病原体丰度等指标筛选阳性结果，排除常见污染菌（如表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等），结合临床信息出具检测报告。四、临床应用场景及价值（一）呼吸系统感染呼吸系统感染是临床最常见的感染类型，mNGS可有效检测细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等多种病原体，尤其是对于重症肺炎、难治性肺炎患者。对于常规检测阴性的重症肺炎患者，mNGS检测阳性率可达40%-60%，可明确如肺孢子菌、曲霉菌、新型冠状病毒、鹦鹉热衣原体等少见病原体，为调整治疗方案提供依据。此外，mNGS可检测出抗菌药物耐药基因，指导精准抗菌治疗。（二）中枢神经系统感染中枢神经系统感染病情凶险，常规脑脊液检测阳性率不足30%。mNGS可检测出病毒（如单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、肠道病毒）、细菌（如结核分枝杆菌、李斯特菌）、真菌（如隐球菌、曲霉菌）、寄生虫（如弓形虫）等多种病原体，阳性率可达50%-70%。对于不明原因脑炎患者，mNGS可快速明确病因，尤其是对于自身免疫性脑炎合并感染或罕见病原体感染的患者，具有不可替代的价值。（三）血流感染血流感染是导致脓毒症和感染性休克的主要原因，常规血培养阳性率仅为20%-30%，且检测周期长（3-5天）。mNGS可在24-48小时内明确病原体，阳性率较血培养提高20%-30%，尤其是对于苛养菌（如布鲁菌、军团菌）、真菌（如念珠菌、隐球菌）、病毒（如巨细胞病毒）等病原体，检测优势明显。此外，mNGS可检测出血流感染中的耐药基因，指导临床合理使用抗菌药物。（四）免疫抑制患者感染免疫抑制患者感染病原体复杂，常为机会性感染或混合感染，常规检测难以明确病原体。mNGS可同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原体，阳性率可达60%-80%，可明确如卡氏肺孢子菌、巨细胞病毒、诺卡菌、马尔尼菲篮状菌等机会性病原体，为早期精准治疗提供依据，降低患者死亡率。（五）新发突发传染病应急检测在新发突发传染病疫情中，mNGS可快速识别未知病原体，如2019年新型冠状病毒肺炎疫情中，mNGS首次识别出新型冠状病毒。此外，mNGS可监测病原体的变异情况，为疫苗研发和疫情防控提供数据支持。五、检测结果解读原则（一）区分感染与定植mNGS检测到病原体并不等同于感染，需结合临床症状、体征、影像学检查、实验室指标等综合判断。如痰液中检测到肺炎链球菌，若患者有发热、咳嗽、咳痰、肺部影像学浸润影，则考虑为感染；若患者无感染症状，仅为健康携带者，则为定植。对于定植率较高的病原体（如表皮葡萄球菌、白色念珠菌），需谨慎解读，排除污染或定植的可能。（二）识别真阳性、假阳性与假阴性真阳性：mNGS检测到病原体，且对应临床症状、体征及其他实验室检查支持感染，或经针对性治疗有效。假阳性：常见原因包括样本采集或处理过程中的污染（如试剂中的杂菌、实验室环境中的真菌）、样本中定植菌的干扰、生物信息分析中的假比对等。假阳性结果通常表现为病原体reads数少、丰度低，且无临床感染证据。假阴性：常见原因包括样本中病原体核酸含量低（如感染早期、病原体载量低）、宿主核酸干扰（如血液样本中宿主核酸占比>99%）、核酸提取效率低、测序深度不足、病原体序列未收录于数据库等。（三）少见/罕见病原体的解读当mNGS检测到少见或罕见病原体时，需结合患者的流行病学史（如旅行史、接触史、职业史）、免疫状态等综合判断。如检测到马尔尼菲篮状菌，需询问患者是否有东南亚旅行史或居住史；检测到布鲁菌，需询问患者是否有牛羊接触史。此外，需验证检测结果的真实性，可通过靶向PCR、血清学检测等方法进一步确认。（四）耐药基因的解读mNGS检测到耐药基因并不意味着病原体对该抗菌药物耐药，需结合病原体种类、耐药基因的功能表达、抗菌药物体外药敏试验结果等综合判断。如检测到blaKPC基因，提示革兰阴性杆菌可能对碳青霉烯类抗菌药物耐药；检测到vanA基因，提示肠球菌可能对万古霉素耐药。六、质量控制体系（一）前质量控制样本采集：培训临床医护人员掌握规范的样本采集方法，严格无菌操作，避免样本污染。样本运输与保存：建立样本运输与保存的标准化流程，监控样本运输温度和时间，确保样本质量。样本验收：检验人员对样本进行验收，检查样本类型、采集量、保存状态等，不合格样本需重新采集。（二）中质量控制核酸提取：设置阳性质控品（如已知浓度的大肠埃希菌核酸）和阴性质控品（无核酸水），监控核酸提取效率和污染情况。文库构建：设置阳性质控品和阴性质控品，监控文库构建的效率和污染情况，定期对文库构建试剂盒进行性能验证。测序过程：定期对测序平台进行维护和校准，监控测序数据质量（如Q30比例、GC含量），确保测序数据可靠。（三）后质量控制生物信息分析：设置阳性质控品和阴性质控品，监控生物信息分析的准确性，定期对分析流程进行验证和更新。结果审核：由临床检验医师和临床医师共同审核检测结果，结合临床信息出具报告，避免误判。（四）室间质评积极参加国家或省级临床检验中心组织的mNGS检测室间质评，及时发现检测过程中的问题，持续改进检测质量。七、伦理与管理要求（一）患者知情同意在进行mNGS检测前，需向患者或其家属充分告知检测的目的、意义、费用、潜在风险（如隐私泄露）及局限性，获得书面知情同意。对于急诊危重患者，可先进行检测，后补知情同意手续。（二）数据安全与隐私保护mNGS检测涉及患者的遗传信息，需严格遵守《中华人民共和国个人信息保护法》《医疗机构病历管理规定》等法律法规，建立数据安全管理制度，对患者数据进行加密存储和传输，防止隐私泄露。（三）报告规范管理mNGS检测报告应由临床检验医师和临床医师共同出具，报告内容应包括