百日咳实验室检测技术指南

百日咳实验室检测技术指南本指南规范百日咳鲍特菌感染的实验室检测流程，适用于各级疾病预防控制机构、各级各类医疗机构开展百日咳病例诊断、暴发疫情调查、监测等工作，不同层级实验室可根据自身条件选择适配的检测技术。1标本采集、运送与前处理1.1标本类型与采集时机1.1.1呼吸道标本呼吸道标本用于病原分离培养和核酸检测，是百日咳检测的首选标本类型。百日咳鲍特菌主要定植于鼻咽部黏膜纤毛上皮细胞，因此推荐采集鼻咽拭子或鼻咽吸出物，不推荐采集咽拭子、痰液：咽拭子仅能采集口咽部细胞，百日咳鲍特菌载量低，阳性率较鼻咽拭子低40%以上。采集时机要求：病原分离培养最佳采集时间为发病后3周内，且在未使用抗菌药物治疗前采集。卡他期（发病0~14天）未用药标本阳性率可达80%~90%，痉咳期（发病15~30天）阳性率降至30%~50%，发病4周后病原分离阳性率不足5%。核酸检测最佳采集时间为发病4周内，未用药时卡他期阳性率80%~95%，痉咳期可达50%~70%，发病4周后仍可保持30%~40%的阳性率，显著高于分离培养。1.1.2血清标本血清标本用于血清学抗体检测，主要用于发病4周以上病例的回顾性诊断和流行病学调查。推荐采集双份血清：第一份（急性期）在发病1周内采集，第二份（恢复期）在发病2~4周采集，两份标本间隔时间至少14天。单份血清采集推荐在发病4周后进行，避免因抗体尚未升高出现假阴性。1.2采集方法1.2.1鼻咽拭子采集要求使用聚酯纤维或尼龙纤维拭子，搭配塑料或铝制杆，禁止使用普通棉花拭子、木质杆拭子：棉纤维可吸附百日咳鲍特菌，木质杆含有的植酸等天然物质可抑制病原菌生长，可使阳性率降低20%~30%。操作方法：受检者取坐位，头部保持后仰，拭子经一侧鼻孔缓慢插入，插入深度为鼻尖至同侧耳垂的距离（成人约3~5cm，儿童约1~3cm，婴幼儿约1~2cm），碰到鼻咽后壁后轻轻旋转3圈，停留1~2秒后缓慢取出，全程避免拭子接触口腔黏膜、口唇及舌头，立即将拭子头浸入运送培养基中，折断拭杆，旋紧管盖做好标记。1.2.2鼻咽吸出物采集适用于不能配合采集鼻咽拭子的婴幼儿，阳性率略高于鼻咽拭子（约高5%~10%）。操作方法：将无菌吸痰管经鼻腔插入至鼻咽部，连接负压吸引器，负压维持在100~150mmHg，吸引1~2秒吸出分泌物，之后用2ml无菌Regan-Lowe运送培养基或Amies活性炭培养基冲洗吸痰管，将冲洗液收集至无菌离心管中密封标记。1.2.3血清标本采集采集静脉血3~5ml，置于无抗凝剂的无菌真空采血管中，静置凝固后3000r/min离心10分钟分离血清，转移至无菌冻存管中标记，避免溶血，溶血标本会影响血清学检测结果准确性。1.3标本运送与保存百日咳鲍特菌对外界环境抵抗力弱，对干燥、高温、酸性环境敏感，因此采集后需尽快送检。采集后的呼吸道标本置于运送培养基中，15~25℃室温运送不超过24小时，2~8℃冷藏运送不超过48小时；若需保存超过48小时，需置于-70℃以下冰箱冻存，禁止反复冻融，避免病原菌死亡或核酸降解。血清标本2~8℃可保存1周，-20℃可长期保存，避免反复冻融导致抗体降解。1.4标本前处理对于粘稠的鼻咽吸出物或痰液标本，加入等量无菌pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）振荡混匀，12000r/min离心5分钟，弃上清取沉淀用于接种培养或核酸提取；清亮标本可直接使用。2分离培养法分离培养法是百日咳确诊的金标准，特异性可达100%，可获得分离菌株用于药敏试验、分子溯源、毒力分析等研究，缺点是灵敏度较低，对标本质量、采集时机要求高。2.1培养基制备与选择目前常用培养基为Regan-Lowe（RL）培养基和Bordet-Gengou（BG）琼脂，RL培养基添加了头孢氨苄和活性炭，可有效抑制鼻咽部正常菌群生长，阳性检出率较BG培养基高10%~15%，推荐作为首选培养基。RL培养基配制：将28.3gRL培养基干粉溶于1L蒸馏水中，加热煮沸溶解，冷却至50~55℃，加入10%~15%脱纤维马血，加入头孢氨苄溶液使终浓度为40mg/L，摇匀后倾倒平板，凝固后4℃避光保存，有效期为7天，使用前需置于室温平衡30分钟。BG琼脂配制：将22.5gBG培养基干粉溶于1L蒸馏水中，加热煮沸溶解，冷却至50~55℃，加入15%~20%脱纤维羊血，加入青霉素使终浓度为0.5U/ml，倾倒平板，4℃保存有效期7天。2.2接种与培养用接种环取标本，若为拭子直接在培养基表面涂布一区，再进行三区划线分离，放置于35℃~37℃，含5%~10%CO₂、相对湿度50%~70%的孵箱中培养，培养前3天禁止打开孵箱门，避免气流影响菌落生长。每日观察菌落生长情况，培养满7天无目标菌落生长方可报告阴性，因部分毒力菌株生长缓慢，需5~7天才能形成可见菌落，培养不足7天会导致假阴性，国内统计数据显示，培养3天阴性报告漏检率可达25%以上。2.3菌株鉴定2.3.1菌落形态观察培养4~5天后，百日咳鲍特菌在BG平板上形成直径0.5~1mm、细小、光滑、凸起、无色透明类似水银滴状的菌落，菌落周围有狭窄的β溶血环；在RL平板上形成灰色、半透明、光滑整齐、直径0.5~1mm的菌落，无明显溶血环。2.3.2生化鉴定挑取可疑菌落进行生化试验，百日咳鲍特菌的典型生化特征为：氧化酶阳性、触酶阳性、不发酵任何糖类、尿素酶24~48小时缓慢阳性、硝酸盐还原试验阴性、无动力、吲哚阴性，符合以上特征可初步判定为鲍特菌属。2.3.3确认鉴定可采用以下方法进行确认：①血清玻片凝集试验：用百日咳鲍特菌特异性多价抗血清与可疑菌落混合，发生明显凝集，生理盐水对照不凝集，即可判定为阳性；②核酸鉴定：扩增ptxA或IS481靶标，阳性即可确认；③自动化鉴定系统：VITEK2、BDPhoenix等自动化微生物鉴定系统对百日咳鲍特菌的鉴定准确率可达95%以上；④基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）：准确率可达98%以上，10~15分钟即可出结果，是目前分离菌株快速鉴定的首选方法。2.4结果报告分离培养到百日咳鲍特菌，报告“检出百日咳鲍特菌”，无目标菌落生长，报告“未检出百日咳鲍特菌”。3核酸扩增检测技术核酸检测灵敏度和特异性高，检测速度快，从标本接收到出结果可在24小时内完成，是目前百日咳实验室诊断的首选方法，常用技术为实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR），普通PCR因扩增后开盖电泳污染风险高，不推荐常规使用。3.1靶标选择推荐选择双靶标检测，以提高检测准确性：①插入序列IS481：百日咳鲍特菌基因组中存在50~100个拷贝，灵敏度高，是最常用的靶标，仅少数一株型副百日咳鲍特菌携带少量IS481，结合第二个靶标可排除；②百日咳毒素A亚基基因ptxA：为百日咳鲍特菌特有毒力基因，特异性100%，可区分百日咳鲍特菌与其他鲍特菌。同时必须加入内参基因，推荐选择人源β-actin基因或RNaseP基因，用于监测标本采集质量、核酸提取效率及PCR抑制物，可降低假阴性率15%以上，避免假阴性结果。3.2核酸提取推荐采用磁珠法或硅胶柱法提取核酸，可有效去除标本中的粘液、血红蛋白等抑制剂，获得高纯度核酸，适合自动化操作，不推荐煮沸裂解法，该方法提取的核酸纯度低，抑制剂残留多，灵敏度低，假阴性率可达15%~20%。提取后的核酸若不立即检测，需置于-20℃冻存，保存不超过7天，长期保存需置于-70℃。3.3扩增与结果判断按照试剂盒说明书配制反应体系，一般采用25μL反应体系，引物终浓度为0.2~0.4μmol/L，探针终浓度为0.1~0.2μmol/L。反应条件推荐：95℃预变性30秒，1个循环；95℃变性5秒，60℃退火延伸30秒（采集荧光），40个循环。结果判断标准：①两个靶标Ct值均≤35，内参Ct值正常，判为“百日咳鲍特菌核酸阳性”；②单个靶标Ct值≤35，另一个靶标Ct值35~40，重复试验后仍符合该结果，判为阳性；③所有靶标Ct值均>40，内参Ct值正常，判为“百日咳鲍特菌核酸阴性”；④内参Ct值>40，提示标本存在PCR抑制物或核酸提取失败，该结果无效，需重新提取核酸或重新采集标本检测；⑤靶标Ct值在35~40之间为灰区，需重复检测，重复后仍为灰区，结合临床疑似病例表现可判为可疑阳性，建议一周后重采标本复检。3.4质量控制要求PCR实验室必须严格分区，分为试剂准备区、标本处理区、扩增分析区，三个区域物理隔离，气流单向流动，不同区域的仪器、耗材、工作服不得交叉使用，每次实验操作后用10%次氯酸钠溶液擦拭台面，紫外线照射30分钟消毒，避免气溶胶污染导致假阳性。每次检测必须设置阴性对照、弱阳性对照、阳性对照，对照结果符合要求方可发报告。3.5性能评价qPCR检测百日咳鲍特菌的灵敏度可达10~100CFU/ml标本，卡他期未用药阳性率可达80%~95%，特异性可达95%~99%，显著优于分离培养，适合临床常规诊断。多重PCR可同时检测百日咳鲍特菌、副百日咳鲍特菌及其他多种呼吸道病原体，适合暴发疫情筛查和疑难病例鉴别诊断。4血清学检测技术血清学检测主要用于发病4周以上病例的回顾性诊断、血清流行病学调查和疫苗效果评价，WHO推荐检测抗百日咳毒素IgG（PT-IgG），其特异性和可靠性显著优于其他靶标。4.1常用方法目前常用方法为酶联免疫吸附试验（ELISA）和化学发光免疫分析法，ELISA操作简便，成本较低，适合大规模流行病学调查；化学发光法自动化程度高，重复性好，灵敏度高，是目前临床诊断常用的方法。所有商品化试剂盒需选择以纯化PT为抗原的试剂盒，不推荐使用全菌抗原，全菌抗原容易与其他鲍特菌、其他呼吸道细菌发生交叉反应，假阳性率可达10%~15%。4.2结果判断标准4.2.1双份血清诊断标准急性期（发病<7天）和恢复期（发病21~28天）双份血清，间隔≥14天，PT-IgG抗体滴度出现4倍及以上升高，即可确诊百日咳感染，该方法特异性可达100%，是血清学诊断的金标准。4.2.2单份血清诊断标准基于WHO推荐的标准，结合我国免疫规划程序，cutoff值设定如下：①未接种过百日咳疫苗的所有人群，发病4周后采集的单份血清PT-IgG≥100IU/ml，即可确诊；②接种过百日咳疫苗，末次接种距离采样时间超过1年，发病4周后采集的单份血清PT-IgG≥100IU/ml提示近期感染，≥140IU/ml即可确诊；③末次接种距离采样时间不足1年，PT-IgG<100IU/ml可排除感染，100~140IU/ml提示可能为疫苗免疫反应或近期感染，需结合临床症状判断，≥140IU/ml提示近期自然感染；④6月龄以内婴儿，排除母体来源抗体（母亲妊娠晚期PT-IgG阴性或婴儿抗体滴度远高于母体），PT-IgG≥50IU/ml即可确诊感染。4.3性能评价发病4周后血清学检测阳性率可达90%以上，对于发病超过1个月的病例，阳性率显著高于核酸和分离培养，特异性可达90%以上，以PT为靶标的试剂盒特异性可达95%以上。缺点是疫苗接种后会导致抗体升高，单份结果需结合末次接种时间判断，早期感染抗体未升高容易出现假阴性。5其他检测技术5.1直接免疫荧光法（DFA）用荧光标记的特异性抗体染色鼻咽部脱落细胞涂片，直接荧光显微镜观察，检测速度快，2小时即可出结果，适合基层实验室快速筛查，灵敏度仅为40%~60%，假阳性率可达10%~20%，因此不能作为确诊依据，阳性结果需经核酸或培养确认。5.2宏基因组二代测序（mNGS）可直接从临床标本中检测所有病原体核酸，无需提前预判，适合不明原因长期咳嗽、重症肺炎等疑难病例的病因查找，缺点是检测成本高，灵敏度低于qPCR，容易被宿主背景核酸干扰，因此不作为常规检测推荐，仅用于疑难病例诊断。6质量控制1.室内质量控制：所有检测项目每次检测必须带入阴、阳性质控品，核酸检测需设置弱阳性质控监测检测灵敏度，血清学检测需设置高低浓度抗体质控，分离培养每批新配制培养基需用标准菌株（ATCC9797）进行生长试验，合格后方可使用。室内质控失控时，需查找原因（如试剂过期、污染、操作误差），整改后重新检测所有本批次标本。2.室间质量评价：实验室需定期参加国家或省级临床检验中心、疾病预防控制中心组织的百日咳检测室间质评，每年至少2次，室间质评不合格的实验室需暂停检测，整改合格后方可恢复。3.标本质量控制：不符合要求的标本（如咽拭子、送检时间超过72小时的呼吸道标本、凝固溶血的血清标本）直接退回，要求重新采集，不合格标本检测结果不可靠。7结果解读与生物安全要求7.1结果解读符合以下任意一项即可确诊百日咳：①分离培养检出百日咳鲍特菌；②qPCR检出百日咳鲍特菌核酸；③双份血清PT-IgG滴度4倍及以上升高；④单份血清PT-IgG达到对应的确诊cutoff值，且伴有典型百日咳临床症状（阵发性痉挛性咳嗽、咳嗽超过2周、鸡鸣样吼声）。影响结果的常见因素：①抗菌药物使用：使用大环内酯类等敏感抗菌药物后，分离培养阳性率下降70%以上，核酸阳性率下降10%~20%，因此培养阴性不能排除诊断，需结合核酸或血清学结果判断；②采集时机：发病