【《核糖核酸酶研究的国内外文献综述》3400字】

核糖核酸酶研究的国内外文献综述核糖核酸酶家族及各成员核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)在自然各界中分布极广，它能可以作用于单链、双链或者DNA与RNA杂合的底物，催化RNA的降解，细胞中无处不存在核酸酶(LuhtalaandParker2010)。已有大量研究证明RNase在DNA合成、RNA转录后剪切修饰、细胞质和细胞核内RNA降解、RNA干扰、植物自交不亲和性、和抗病毒宿主防御机制等细胞途径中起重要作用(刘军和薛采芳2002;钱敏等2004)。根据反应最适的pH值的不同，核酸酶可以分为酸性核糖核酸酶(AcidRNase,ACR)和碱性核糖核酸酶(AlkalineRNase,AKR)(钱敏等2004)。根据基础特性、结构、功能和反应最适pH等条件，核糖核酸酶可以分为核糖核酸酶A超家族、核糖核酸酶T1与核糖核酸酶T2家族(WuLetal.2020)，这三种常见核酸酶的基本信息概括于表1-1。下文对主要对RNaseA和RNaseT2家族的成员做简要介绍。表1-1常见核糖核酸酶基本信息Table1-1Thebasicinformationofnormalribonucleases蛋白家族细胞定位反应最适pH值底物特异性RNaseT2各界广泛存在酸性(pH4-5)弱RNaseA主要存在于动物中弱酸性(pH6.5-7)或碱性(pH7-8)嘧啶类RNaseT1特定真菌和细菌中碱性(pH7-8)鸟嘌呤核糖核酸酶A超家族及其生物学特性RNaseA超家族的成员主要分布于脊椎动物中，一般由一百多位氨基酸组成，它们虽然蛋白序列相异，但是都有特殊的同源序列：由二硫键构成的三级结构(董安康2014;Rosenberg2008)。部分RNaseA蛋白还带有大量正电荷，对细胞产生毒性，具有杀菌的作用，嗜酸性粒细胞的RNaseA-2凭借这种功能在宿主防御中起重要作用。有趣的是，少数RNaseA家族成员在宿主中起的防御作用并不依赖其核酸酶的活性，RNaseA-2也是其中之一(Rosenberg2008)。牛胰腺核糖核酸酶A(bovinepancreaticribonucleaseA,RNaseA)是最早研究发现的核糖核酸内切酶之一。它由124位氨基酸组成，分子量为13.64kDa，其空间布局如图1-1所示。RNaseA含4个二硫键(二硫键位置：26-84,40-95,58-110,65-72)，这些二硫键与RNaseA家族蛋白的结构稳定性与耐热性密不可分，RNaseA的反应最适pH为7.0-7.5，对嘧啶类有碱基偏好性(董安康2014;DyerandRosenberg2006)。RNaseA也是实验室中用于去除样品中RNA最常用的根据酶。图1-1RNaseA蛋白结构图Figure1-1ThestructureofRNaseA核糖核酸酶T2家族及其生物学特性核糖核酸酶T2家族蛋白的大小约是RNaseA和RNaseT1的两倍，并且在自然界的分布更为广泛。T2家族的核酸酶是核糖核酸内切酶中的一个亚族，是RNase中的转运酶类，根据与来源于Aspergillusoryzae(DeshpandeandAShankar2002)的RNaseT2的相似度来辨别是否为该家族成员。核糖核酸酶T2通过2’,3’-环磷酸中间体剪切单链RNA，产生带有3’磷酸末端的单核苷酸或者寡聚核苷酸。T2家族的核糖核酸酶较RNaseA和RNaseT1蛋白家族有以下三个特征。第一，T2核糖核酸酶分布更为广泛，在原生生物、植物、细菌、动物和病毒内都有迹可循(LuhtalaandParker2010)，然而，RNaseT1只存在于细菌或者真菌生物体内，而RNaseA则在动物体内大量存在。第二，T2核糖核酸酶反应的最佳pH值分布在4到5之间，而RNaseT1和RNaseA家族的酶则需碱性(pH7-8)或者弱酸性(pH6.5-7)的反应条件(LuhtalaandParker2010)。T2的酶在酸性条件下的活性于其在液泡与溶酶体的定位相符合，这也说明在酸性区域剪切自身RNA是T2核糖核酸酶的一个功能。第三，T2核糖核酸酶对四种碱基底物均有剪切作用，而RNaseA和RNaseT1家族的成员分别对嘧啶类与鸟嘌呤有特性性偏好(LuhtalaandParker2010)。T2核糖核酸酶剪切RNA的结构及机制已被充分地理解。大量对于细菌、植物和真菌T2家族成员晶体结构地研究揭示了该家族一个保守的α/β核心结构。T2蛋白的催化作用由位于酶活性部位的两个保守氨基酸模块CASI和CASII(conservedactivesite)中的1到3个组氨酸残基催化(WuLetal.2020)。通过DNA突变或化学修饰改变这些组氨酸可以在体外和体内使RNase失活性。虽然RNaseT2分布广泛，该结构域从病毒到哺乳类都高度保守(WuLetal.2020)。T2核糖核酸酶被在不同的生物体中具有多种不同的功能，包括清除核酸、降解自身RNA、调节宿主免疫反应，以及作为细胞外或细胞内的细胞毒素。有趣的是，其中一些作用似乎与RNA的水解能力无关。核糖核酸酶I的研究现状RNaseⅠ的来源RNaseⅠ是核糖核酸内切酶，属于RNaseT2家族，主要存在于大肠杆菌细胞周质，RNaseⅠ非常稳定，与大肠杆菌的应激有关，在一些营养元素缺乏的条件下，大肠杆菌会水解核糖体来供应自身生存所需要的各种元素，水解rRNA是水解核糖体的第一步，所以该酶多用于在应激情况下水解rRNA。RNaseⅠ的结构RNaseⅠ共有268氨基酸组成，分子量为27kDa。如图1-2所示，作为核糖核酸酶T2家族成员，RNaseI也包含了T2家族的保守α/β核心结构。图1-2RNaseI结构图Figure1-2ThestructureofRNaseIRNaseI包含四个色氨酸残基，从这些侧链显示出很强的荧光。天然RNaseI的色氨酸荧光发射光谱在325nm处达到最大值，其最大吸收峰值在变性剂打开三级结构后会有所改变(PadmanabhanSetal.2001)。RNaseⅠ也包含四个组氨酸，其中三个(H55,H133,H230)位于活性中心，如图1-2所示，能与配体形成非共价键。活性RNaseⅠ的N端有一个包含半胱氨酸的柔性区，是一个亲水元件，在中性条件下带有电荷，易与核苷酸形成氢键、盐桥，所以RNaseI剪切RNA相对无碱基偏好性(PadmanabhanSetal.2001)。该亲水片段与活性中心较远。RNaseI整体翻译后修饰会存在四个二硫键，二硫键的存在稳定了RNaseI的结构。RNaseⅠ的理化性质RNaseⅠ的等电点为8.59。RNaseⅠ作为核糖核酸内切酶，能水解单链RNA，打断2’-3’磷酸键，形成3’单磷酸核苷酸。RNaseI水解RNA活性很高，在EDTA存在的反应环境中，大肠杆菌细胞抽提物>99%的RNase活性都是由RNaseI提供的(SubbarayanandRdeutscher2001)，且RNaseI降解聚合物RNA的速率与RNA均聚物或RNA低聚物相当(CannistraroandJKennell1991)。RNaseⅠ具有较好的耐热性，在碱性环境中的活性更高，多胺类有利于其水解活性。RNaseⅠ无二价金属离子依赖性，Zn2+能激活RNaseⅠ(CannistraroandJKennell1991)，而汞离子对RNaseⅠ的活性有抑制作用(ZhuLQetal.1990)。哺乳类的核糖核酸酶抑制剂对RNaseⅠ无作用；RNaseⅠ会与DNA结合但是不降解DNA；非离子去垢剂如TritonX-100对RNaseⅠ无抑制作用，甚至能轻微地提高活性，在热失活的时候TritonX-100甚至能使蛋白更稳定；0.1%的SDS使蛋白质不可逆失活；100℃10min可使蛋白失活。RNaseⅠ相似的蛋白：S-RNase与RNaseMS-RNase与RNaseM都是核糖核酸酶T2家族中与RNaseⅠ相似度较高的核酸酶。S-RNases存在于茄科、蔷薇科和桑科的植物中，其作用是维持授粉过程中的自交不亲和与其他花粉排斥(LuhtalaandParker2010)。S-RNases是一种雌蕊蛋白质，约为30kDa，被分泌到细胞外基质中，为花粉从柱头进入到子房打通道路。虽然S-RNase与RNaseⅠ性质相似，但是RNaseⅠ无法替代S-RNase独自起到维持植株自交不亲和的作用(McClureetal.1998)。RNaseM也来自大肠杆菌，只存在于大肠杆菌的细胞质中，主要在菌体生长过程中降解菌体不需的mRNA(MeadorJRetal.1990)。RNaseM与RNaseⅠ的大小和氨基酸序列都惊人地相似，加上大肠杆菌的基因组中不存在其他与rna基因相似的基因，研究者们认为，RNaseM是RNaseⅠ的另一种存在形式，都是rna基因的产物，只是RNaseM存在于胞内而RNaseⅠ存在于周质中，且较RNaseⅠ相比，存在于胞质的RNaseM水解RNA活性更弱。至于RNaseⅠ如何实现跨膜转换的还需后续的研究(SubbarayanandRdeutscher2001)。参考文献陈芳霞,陈鹏.2016.热敏型核酸酶在毕赤酵母中的分泌表达及催化特性.生物工程学报,32(07):991-995董安康.2014.核糖核酸酶A超家族及其生物学活性.吉林化工学院学报,31(07):8-11耿雪冉,柳万石,王贺祥.2015.污白干酪菌核糖核酸酶的分离纯化和理化性质.中国食用菌,34(06):63-66耿雪冉,张巧毅,常明昌,徐丽婧,程艳芬,王贺祥.2019.三色雷蘑核糖核酸酶的分离纯化和理化性质.食用菌学报,26(02):59-64剧海,梁东春,郭刚,张镜宇.2003.用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较.天津医药(05):270-272柯雪丹,余传信,宋丽君,菊池三惠子,平山谦二,王玠,殷旭仁,金一,沈双,姚媛,高玒,高琪.2013.日本血吸虫核糖核酸酶T2的表达及其功能分析.中国病原生物学杂志,8(12):1082-1088刘军,薛采芳.2002.治疗用核糖核酸酶的研究进展.生命科学,14(3):139-140,138钱敏,李关荣,鲁成.2004.核糖核酸酶研究进展.蚕业科学,30(2):185-190尚金召,王雪芹,熊聿力,路福平,刘夫锋.2019.hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定.天津科技大学学报,34(06):25-30邵丽军,刘照惠,金立杰,李利,李猛,谷丽娟,赵晓林,杨屹.2006.HBVPreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达.中国生物制品学杂志(03):255-258王敏敏,赵婕,常亚磊,陈浩男,陈思思,宋静,魏建宏.2017.双酶切和无缝克隆方法构建HCVCORE表达载体的比较.山西医药杂志,46(03):267-270王媛,贾鹏,李学俊,李玉红,陈鹏.2018.水稻N-糖酰胺酶基因(OsPNGaseA)的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达.生物工程学报,34(03):421-428薛俊龙,王采先,詹丽娥,张李俊,田林君,李红丽,侯明全.2005.两种物理方法破碎大肠杆菌比较试验.山西农业科学,33(4):77-79杨小盼,董立厚,万德有,华玲,刘蕴慧,高新.2013.毕赤酵母电转化方法的探索.生物技术通报(12):156-161于超生,文忠,邹泽红,陈惠芳,陶爱林.2011.蛔虫过敏原ABA-1融合基因在大肠杆菌中的表达及鉴定.中国组织工程研究与临床康复,15(20):3679-3682张秀华,钊倩倩,刘飞,朱希强.2016.重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究.中国生化药物杂志,36(04):37-40CannistraroVJ,KennellD.1991.RNaseI*,aformofRNaseI,andmRNAdegradationinEscherichiacoli.Journalofbacteriology,173(15):4653-4659DeshpandeRA,ShankarV.2002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