CN119421947A 用于生产重组病毒载体的高密度真核细胞瞬时转染方法 （菲克塞尔生物科技公司）

2024.12.24PCT/EP2023/0670492023.06.22WO2023/247733EN2023.12.28用于生产重组病毒载体的高密度真核细胞本发明提供了一种在真核细胞中制备重组培养物具有至少25MVC/mL的出人意料的高细胞2a)获得细胞密度为每毫升至少2500万活b)用外源质粒DNA或多种不同的外源质粒DNA对所述细胞悬浮液中的细胞进行瞬时转d)在步骤b)的转染和/或可选的细胞恢复步骤c)之后，对存在于所述细胞悬浮液中的步骤a)的所述细胞悬浮液的细胞密度为每毫升步骤a)的所述细胞悬浮液的细胞密度为每毫升步骤a)的所述细胞悬浮液的细胞密度为每毫升步骤a)的所述细胞悬浮液使得所述悬浮液的细胞占培养物体积的至少6％的部分，并3步骤a)的细胞密度是通过浓缩所述细胞悬浮液中的细胞含量和/或通过在培养物悬浮所述瞬时转染包括利用化学试剂的化学转染，所述化学试剂选所述聚乙烯亚胺是具有线性或支化拓扑结构的合成阳离子聚合物，4[0002]瞬时转染是一种基因转移技术，广泛用于生产具有生物活性的分子或分子组装5染，这通常是通过在转染前一天将生长细胞的密度设置为0.6到0.8百万活细胞每毫升或时间段之后，重组病毒载体的生产步骤以至少20MVC/mL的出人意料的高细胞密度开始，6a)获得细胞密度为每毫升至少2500万活细b)用生产重组病毒载体所需的外源质粒DNA或几种外源质粒DNA对细胞悬浮液中a)获得细胞密度为每毫升至少2500万活b)用外源质粒DNA或多种不同的外源质粒DNA对细胞悬浮液中的细胞进行瞬时转d)在步骤b)的转染和/或可选的细胞恢复步骤c)之后，对存在于所述细胞悬浮液[0015]然后在转染后的一段时间内收获靶重组病毒载体，通常在转染(hpT)后24_240小[0017]图1示出了在50MVC/mL下进行的本发明瞬时转染过程中，使用不同比例的细胞数7[0018]图2示出了在50MVC/mL下进行的瞬时转染过程中，72hpT下rAAV衣壳/mL的生产滴[0019]图3示出了在100MVC/mL下进行本发明的瞬时转染过程后，rAAV衣壳/mL的生产滴[0021]图5示出了在200mL工作体积的灌流生物反应器培养中，使用细胞密度>80MVC/mL时转染过程进行rAAV病毒载体的生产，同时示出了2MVC/mL活细胞密度和15MVC/mL活细胞密度的两个对照培养物，其中转染过程在37℃CO2培养箱中的伪灌流微型生物反应器中进[0023]图6的(A)示出了生物反应器中的长期生产，在生产阶段活细胞密度高达120MVC/物反应器中将病毒基因组产量/mL(右侧图案一实心圆)以15MVC/mL的细胞密度进行转染的效率，用于受感染细胞的GFP表达所表明的转导试验(实心条)。为了进行比较，参考文献(Ref)中的转染是在1MVC/mL的低细胞密度下在摇瓶中进行的，上清液是在转染后3天收集[0025]图7示出了本发明在50MVC/mL细胞密度下进行的rAAV病毒载体的几种瞬时转染生8[0027]本文中未具体定义的术语应具有本领域技术人员根据本公开和上下文赋予它们通常在搅拌罐生物反应器或搅拌培养容器中以混合物的形式生长，以确保向细胞输送营体生产的常规方法相比，生产所述重组载体的起始细胞密度为每毫升至少2000万个活细9胞密度的细胞悬浮液中发生的诸如营养和氧气获无菌空气/氧气。细胞恢复不是本公开中的必要步骤，细胞恢复时间可以在很大范围内变[0040]本发明提供了高细胞密度瞬时转染真核细胞以高产率生产重组病毒载体的方何方法或过程的背景下讨论的具体过程步骤或情况同样适用于本文公开的任何其他过程a)获得细胞密度为每毫升至少2500万活b)用外源质粒DNA或多种不同的外源质粒DNA对细胞悬浮液中的细胞进行瞬时转d)在步骤b)的转染和/或可选的细胞恢复步骤c)之后，对存在于所述细胞悬浮液[0050]本发明还提供一种方法，其中，在开始步骤d)的生产之前，不进行会产生低于[0051]培养基交换和灌流过程示出与转染过程后保持高细胞密度以及在生产阶段结束[0053]本文所述方法的步骤d)的生产可以进行至少24小时，例如至[0054]步骤a)的细胞悬浮液可以使得所述悬浮液的细胞占培养体积的至少6％的部分，[0058]该方法的步骤a)的细胞密度是通过浓缩所述细胞悬浮液中的所述细胞含量和/或转染后，可以根据宿主细胞类型、质粒DNA和使用的瞬时转染方法进行可选的细胞恢复过[0062]实现高细胞密度培养的关键因素是平均高存活率，这在瞬时转染过程中很难维亚胺原位转染悬浮液适应的HEK_293细胞，然后以较低的细胞密度(1MVC/mL)进行生产报道了一种转染过程，可以在15_25MVC/mL的较高转染细胞密度下产生病毒样颗粒需要在电穿孔后稀释以开始生产阶段。到目前为止，电穿孔后报告的最高细胞密度为a)获得细胞密度为每毫升至少2500万活b)用生产重组病毒载体所需的外源质粒DNA或几种外源质粒DNA对细胞悬浮液中d)在转染步骤b和/或可选的细胞恢复步骤c之后，对所述转染细胞进行有限稀释[0067]在本公开的方法的一些实施方案中，细胞培养悬浮液的细胞密度为每毫升至少[0068]在本公开的方法的一些实施方案中，细胞培养悬浮液的细胞密度为每毫升至少[0069]在本公开的方法的一些实施方案中，细胞培养悬浮液的细胞密度为每毫升至少[0070]在本公开的方法的一些实施方案中，细胞培养悬浮液的细胞密度为每毫升至少1MDCK,HEK_293,HEK_293T,HEK_293S,HEK_293F,L293,NIH_3T3,W138,BT483,Hs578T,HTB2,BT20,T47D,NS0,CRL7030,HsS78Bstcells,PER.C6,SP2,SP0,hybridoma,MRC_5,MDCK,WI_的细胞悬浮液的细胞密度可以通过如本文其他地方所述通过浓缩和/或培养调节培养悬浮[0083]显微注射是一种直接将DNA递送到细胞核的技术，而电穿孔利用电势诱导细胞膜属粒子将外源基因递送到细胞的技术。声穿孔利用流体中的物理干扰在细胞膜中诱导孔，(Gibco)。当在锥形瓶中扩增并在旋转管(50mLCorning)或管式旋转生物反应器(50mL[0094]电穿孔MaxcyteExPERTSTx与多个CL2单元一起使用，处理能力为100mL/单元高工作体积为200mL，使用交替流动过滤器作为带有微滤器50mMTris、150mMNaCl和2mMMgCl2的裂解缓冲液中，然后通过在_80℃的异[0098]用BioprofileFLEX(NovaBiomedical)或NormaXS(Iprasense)测量细胞密度。葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵的浓度由CedexBio(Roche)测量。通过两台流式细胞仪，Gallios(BeckmanCoulter)和GuavaEasyCyte(LuminexCorporation)测量转染效率(GFP强度)。用AAV1和AAV9滴定ELISA试剂盒(ProgenBiotechnik)对生产的病毒载体衣壳进行[0102]将悬浮生长的HEK293细胞保存在37℃的CO2培养箱中的锥形细胞培养瓶中。将处同。根据该领域常用的标准转染方案在正常细胞密度下进行两组1MVC/mL的转染，作为参过ELISA(酶联免疫吸附试验)对生产滴度进行定量，ELISA分析收获物中组装的rAAV衣壳。始，转染以50MVC/mL进行，细胞、质粒DNA和PEI之间的比例各不相同。这些组以细胞数不同孵育时间下具有非常高的细胞密度转染过程。转染是通过无AAV辅助剂的多质粒瞬时病毒rep(复制)和cap(衣壳)基因。质粒pHelper携带生产感染性AAV所需的腺病毒基因产[0107]将悬浮生长的HEK293细胞保存在37℃的CO2培养箱中的锥形细胞培养瓶中。将处于指数生长阶段的细胞离心至活细胞密度50MVC/mL，高密度细胞培养物在微型生物反应器与质粒生产和PEI相关的成本。将DNA和PEI混合后，使用不同的孵育时间：施加5分钟3mL细胞悬浮液中以进行转染，并将培养物保持在相同的培养容器中的培养箱中，直至在pHelper携带生产感染性AAV所需的腺病毒基因产物。这种功能是产生感染性AAV颗粒所必[0110]将悬浮生长的HEK293细胞保存在37℃的CO2培养箱中的锥形细胞培养瓶中。在转℃的CO2培养箱中摇动带有通气盖的50mL管式容器，在极高细胞密度100MVC/mL下的转染在进行培养基交换，与在18小时时进行第一次培养基交换的条件3相比，这导致rAAV产量较[0114]在转染前7天，将悬浮生长的HEK293细胞接种到工作体积为220mL的生物反应器转染前的96％下降到4hpT(0dpT)时的82这是转染反应的正常存活率下降。在转染后的pHelper携带生产感染性AAV所需的腺病毒基因产物。这种功能是产生感染性AAV颗粒所必[0117]在转染前13天，将悬浮生长的HEK293细胞接种到工作体积为200mL的生物反应器胞密度(约1至2MVC/mL)的培养基中增殖的细胞通过个CL2单元依次用于200mL细胞悬浮液的电穿孔。将来自生物反应器A的细胞悬浮液泵入电经过电穿孔。向收集容器B中加入10mLDNase1，以中和电穿孔细胞悬浮液中过量的游离[0120]在实施例6中，瞬时转染过程是PEI介导的50MVC/mL的非常高的细胞密度转染过[0121]在转染前8天，将悬浮生长的HEK293细胞接种到工作体积为200mL的生物反应器a品置于易受这些感染性病毒载体感染的细胞中来评估样品中含有的感染性病毒载体的功这在批量模式的小规模系统中是不可行的。图6的(B)显示了相同过程的转导试验结果。生产阶段，与使用相同细胞和转染试剂以1MVC/mL转染的对照组相比，感染滴度增加了约[0123]在实施方式7中，使用宿主细胞、HEK293F和病毒生产细胞2.0(VPC2.0，购自毒rep(复制)和cap(衣壳)基因。质粒pHelper携带生产感染性AAV所需的腺病毒基因产物。质粒pHelper携带生产感染性AAV所需的腺病毒基因产物。这种功能是产生感染性AAV颗粒[0124]将悬浮生长的HEK293F细胞和VPC2.0细胞保存在37℃的CO2培养箱中的锥形细胞FS293培养基中用PEIFS293培养基中用P