CN119421955A 用于靶向大豆基因组基因座中的供体多核苷酸的组合物和方法 （先锋国际良种公司）

2024.11.25PCT/US2023/0673372023.05.23WO2023/230459EN2023.11.30用于靶向大豆基因组基因座中的供体多核提供了用于大豆基因组整合位点的组合物包括用位点特异性核酸酶靶向大豆基因组整合22.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述基因组整合位点包含SEQID3.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述基因组整合位点包含SEQIDNO:1_109或SEQIDNO:264_34.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中低多样性基因组区域的遗传大小小5.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中低多样性基因组区域的物理大小小7.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述整合位点距异染色质的距离大8.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述单倍型频率的范围为80％至12.如权利要求11所述的大豆基因组整合位点，其中所述基因表达盒包含杀昆虫抗性13.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述整合位点包含至少一个靶位14.如权利要求13所述的大豆基因组整合位点，其中所述靶位点被位点特异性核酸酶15.如权利要求14所述的大豆基因组整合位点，其中所述位点特异性核酸酶选自由锌16.如权利要求1所述的大豆基因组整合位点，其中所述整合位点序列在将供体DNA插述的重组序列。b.将位点特异性核酸酶引入植物细胞中，其中所述位点特异性核酸酶切割所述靶位3d.将所述供体DNA靶向所述基因组整合位点的所述靶位点中，其中所述靶位点的切割e.选择包含靶向所述基因组整合位点的所述靶位点的所述供体DNA的转基因植物细20.如权利要求19所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因表达盒包含21.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述位点特异性核酸22.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞23.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞24.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因组位点包含25.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因组整合位点26.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因组整合位点27.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中低多样性基因组区域28.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中低多样性基因组区域的物理大小小于2.6Mb并且范围为785,29.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述整合位点包含常30.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述整合位点距异染31.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述单倍型频率的范32.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物433.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述整合位点不发生34.如权利要求20所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因表达盒表达35.如权利要求34所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中所述基因以1至100,36.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中将所述转基因植物细37.如权利要求18所述的制备转基因大豆植物细胞的方法，其中将选择的转基因植物b.选择在所述基因组整合位点处具有所述供38.一种鉴定用于供体多核苷酸的位点特异性核酸酶介导的整合的大豆基因组整合位其中用位点特异性核酸酶靶向所述大豆基因组整合位点，以39.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述供体多核苷酸包40.如权利要求39所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述基因表达盒包含41.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述位点特异性核酸42.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其43.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中44.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述基因组整合位点545.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述基因组整合位点46.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中低多样性基因组区域47.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中低多样性基因组区域的物理大小小于2.6Mb并且范围为785,48.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述整合位点包含常49.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述整合位点距异染50.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述单倍型频率的范51.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合52.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述整合位点不发生53.如权利要求38所述的鉴定大豆基因组整合54.如权利要求40所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述基因表达盒表达55.如权利要求54所述的鉴定大豆基因组整合位点的方法，其中所述基因以1至100,6[0002]本申请要求2022年5月26日提交的美国临时专利申请序列号63/346112的权益的交。包含在该XML格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入努力和成本来鉴定转基因事件的位置并选择按设计进行且对大豆植物没有农艺影响的转在开发方法和组合物方面取得了显著进展以诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失并促进外源供体DNA多核苷酸在预定基因组基因座内的靶向重组，这些方法和组合物用以酸酶(TALEN)和具有工程化crRNA/tracrRNA的成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR7述了非经典锌指核酸酶(ZFN)用于植物基因组的靶向修饰的用途，以及美国专利公开号20090205083描述了ZFN介导的植物EPSP基因组基因座的靶向修饰。用于外源DNA的靶向插入的当前方法典型地涉及用含有至少一个转基因的供体DNA多核苷酸和位点特异性核酸酶导致在包含活跃转录的编码序列的特定基因组基因座处的靶向基[0008]一种替代方法是将转基因靶向大豆植物基因组内的预选基因组整合位点。近年有限，因此需要鉴定和表征可用于靶向供体多核苷酸序列的可靶向的最佳基因组基因座。8物细胞的整合位点紧密地接近端粒，其中该紧密地接近为距染色体末端小于20cM或小于[0011]本文公开了用于制备包含靶向基因组整合位点的供体DNA的转基因大豆植物细胞转基因大豆植物细胞的方法包括将供体DNA靶向基因组整合位点的所述靶位点中，其中所细胞的方法包括选择包含靶向基因组整合位点的所述靶位点的供体DNA的转基因植物细物细胞的方法包括供体DNA，该供体DNA经由同源定向修复整合方法整合在所述靶位点内。9位点，该基因组位点的低多样性基因组区域小于10cM并且范围为1cM至10cM。在另外的方所述基因组整合位点处具有该供体DNA的大豆植物；将所述选择的大豆植物杂交以产生后组整合位点的方法包括从至少一种大豆品种获得大豆基因组DNA样品，该大豆基因组整合合位点的方法包括对大豆基因组DNA样品进行基因分型，该大豆基因组整合位点用于供体方法的包括鉴定大豆基因组DNA样品的单倍型，该大豆基因组整合位点用于供体多核苷酸大豆基因组整合位点的方法的另外的方面，该位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶、用于位点特异性核酸酶介导的整合。在鉴定大豆基因组整合位点的方法的进一步的方面，该供体DNA经由同源定向修复整合方法整合在所述靶位点内，该大豆基因组整合位点用于的整合。在鉴定大豆基因组整合位点的方法的进一步的方面，该基因组整合位点包含SEQ小小于10cM并且范围为1cM至10cM，该大豆基因组整合位点用于位点特异性核酸酶介导的小于2.6Mb并且范围为785,899bp至954,789bp，该大豆基因组整合位点用于位点特异性核用于位点特异性核酸酶介导的整合。在鉴定大豆基因组整合位点的方法的进一步的方面，单倍型频率范围为80％至100该大豆基因组整合位点用于位点特异性核酸酶介导的整点用于位点特异性核酸酶介导的整合。在鉴定大豆基因组整合位点的方法的进一步的方下中的任一项满足：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存基本上不含污染物(通常与天然(native或natural)环境中的分子或化合物相关)的形式，编码序列具有小于80％序列同一性的任何转基因/暴露于增加或减少基因表达的药剂)的影响。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的化或降解或者通过其组合而发生。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于或者通过其组合而发生。可以通过本领域已知的任何方法(包括但不限于Northern印迹、列的dsRNA，单个转基因基因座可触发TGS和PTGS。Mourrain等人(2007)Planta[植物学]会通过将转基因序列的甲基化扩散到内源性启动子中引发顺式和反式同源序列的沉默和和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起离散元件(例如特定的核苷酸序列)在另一元件的5'方向上结合同一核酸或将结合同一核是或将要从另一个元件在3'方向上与相同的核酸结合，则离散元件相对于那个元件可以是的氢键合杂交，包括沃森_克里克(Watson_Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定且特异性的结合。寡核苷酸不必与其靶序列100％互补即[0040]导致特定严格性程度的杂交条件将根据所选择的杂交方法的性质以及杂交核酸两个或更多个氨基酸或核苷酸序列之间进行比较的序列中相应同一位置之间的同一匹配程序可以分为全局序列比对程序或局部序列端分析。如BLAST的局部序列比对程序可用于比较两个序列的特定区域。两个序列的BLAST比较会产生E值或期望值，该值表示具有得分等于或优于原始比对得分(S)的不同比对的数一个元素，所以对于任何给定的查询/条目匹配，通过BLASTing针对公共数据库(如GENBANK)获得的E值通常随着时间的推移而增加。在设定多肽功能预测的置信度标准时，“高”BLAST匹配在本文中被认为具有对于最高BLAST命中而言的E值小于1E_30；中等的覆盖率和命中覆盖率的组合来确定本发明中的蛋白质功能分配。查询覆盖率是指查询序列以BLAST比对表示的百分比。命中覆盖率是指以BLAST比对方式表示的数据库条目的百分中]_p<1e_30或％identity[同一性]>35％且query[查询]_coverage[覆盖率]>50％且hit [命中]_coverage[覆盖率]>50或(2)hit[命中]_p<1e_8且query[查询]_coverage[覆盖率]>70％且hit[命中]_coverage[覆盖率]>70％。在序列的BLAST分析过程中会产生以下缩写。[0055]NCBI_GI提供序列最高BLAST命中的GenBankID号。通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)GenBank标识符编号指示的最[0059]TOP_HIT_PCT_IDENT是指沿着最高BLAST匹配中比对的序列的该部分的长度存[0060]CAT_TYPE表示用于对序列进行分类的分类方案。GO_BP＝基因本体协会—生物能层次(KEGG＝京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesand[0063]PRODUCT_HIT_DESC提供对BLAST命中的描述，该结果导致将序列分配给cat_[0065]PCT_IDENT是指沿着在hit_desc中提供的BLAST匹配中比对的序列的该部分的[0068]QRY_CVRG提供与BLAST匹配中的命中(NCBI)序列匹配的查询序列长度的百分比[0069]HIT_CVRG提供使用BLAST生成的匹配中与查询序列匹配的命中序列长度的百分生物信息学计算套件的MegAlign程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一(1989)CABIOS[计算机应用生物科学]5:151_3；Higgins等人(1992)Compu酸序列之间的百分比同一性(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:SSEARCH、LALIGN等)的FASTA套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Pearson(1994)Comput.MethodsGenomeRes.[基因组研究中的计算方法]酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Notredame,等人(2000)J.Mol.Biol.[分子生物学杂DIALIGN_TX、DIALIGN_T等)的DIALIGN套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(AlAit,等人(2013)DIALIGNatGOBICS[在GOBICS的DIALIGN]Nuc.Acids两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Edgar(2004)NucleicAcidsRes.[核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Katoh等人(2002)NucleicAcidsResearch[核酸研氨基酸序列之间的百分比同一性(Albrecht,Felipe.arXiv130702987v1[cs.DC]2015年7月计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Nguyen与Lavenier.(2009)BMC序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Edgar(2010)Bioinformatics[生核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Hughey与Krogh(1995年1月)TechnicalReportUCSC0CRL_95_7[技术报告UCSC0CRL_95_7],UniversityofCalifornia[加利福尼亚大之间的百分比同一性(O'Kane,K.C.,TheEffectofInverseDocumentFrequencyWeightsonIndexedSequenceRetrieval[反向文档频率权重对索引序列检索的影响],比同一性(Daily,Jeff.Parasail:SIMDClibraryforglobal,semi_global,andlocalpairwisesequencealignments.[用于全局、半全局和局部成对序列比对的SIMDC文库]使用ScalaBLAST比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(OehmenC,NieplochaJ."ScalaBLAST:AscalableimplementationofBLASTforhigh_密集型生物信息学分析的BLAST的可扩展实现]"IEEETransactionsonParallel&DistributedSystems[IEEE并行与分布式系统汇刊]17(8):740_7492006年8例中，本公开涉及使用SWIPE比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Rognes,T.FasterSmilth_Watermandatabasesearcheswithinter_sequenceSIMDparallelization[通过序列间SIMD并行化，可以更快地进行Smilth_Waterman数据库搜用ACANA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(WeichunHuang,DavidM.Umbach和LepingLi,Accurateanchoringalignmentofdivergentsequences[不同序列的精确锚定比对].Bioinformatics[生物信息学]22:29_34,2006年1月1日)。在同一性(Junier,T.和Pagni,M.DOTLET:diagonalplotsinawebbrowser[DOTLET：网络中，本公开涉及使用G_PAS比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Frohmberg,W.等人G_PAS2.0–animprovedversionofproteinalignmenttoolwithanefficientbacktrackingroutineonmultipleGPUs.[G_PAS2.0–在多个GPU上具有高效的回溯程序的蛋白质比对工具的改进版本]BulletinofthePolishAcademyof同一性(Flouri,T.等人,GapMis:Atoolforpairwisesequencealignmentwitha套件计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，该套件包括但不限于：Matcher、Needle、Streter、Water、Wordmatch等(Rice,P.,Longden,I.和Bleasby,A.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.生物学开放软件套件]TrendsinGenetics[遗传学趋势]16(6)276_77(2000))。在实施例中，本公开涉及使用Ngila比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Cartwright,R.Ngila:globalpairwisealignmentswithlogarithmicandaffine程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Mückstein,U.,Hofacker,IL和Stadler,PF.Stochasticpairwisealignments.[随机成对比对]Bioinformatics[生物信两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Hardy,P.和Waterman,M.TheSequence酸序列之间的百分比同一性(Huang,X和Miller,W.ATime_Efficient,Linear_SpaceLocalSimilarityAlgorithm[省时的线性空间局部相似性算法].AdvancesinApplied比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Okonechnikov,K.,Golosova,O.和Fursov,M.UniproUGENE:aunifiedbioinformaticstoolkit.[Unipro同一性(Suchard,MA与Redelings,BD.BAli_Phy:simultaneousBayesianinferenceofalignmentandphylogeny[BAli_Phy：比对和系统发育的贝叶斯同时推断]By_Base比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Brodie,R.,等人Base_By_Base:Singlenucleotide_levelanalysisofwholeviralgenomealignments[Base_By_Base：全病毒基因组比对的单核苷酸水平分析],BMC对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(ESWright(2015)"DECIPHER:harnessinglocalsequencecontexttoimproveproteinmultiplesequencealignment.[DECIPHER：利用局部序列上下文改善蛋白质多序列比对]"BMC开涉及使用FSA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Bradley,RK等人(2009)FastStatisticalAlignment[快速统计比对].PLoSComputational计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Kearse,M.,等人(2012).GeneiousBasic:anintegratedandextendabledesktopsoftwareplatformforthe序列数据组织和分析的桌面软件平台]Bioinformatics[生物信息学],28(12),1647_49)。比同一性(Lassmann,T.与Sonnhammer,E.Kalign–anaccurateandfastmultiplesequencealignmentalgorithm.[Kalign–准确和快速的多序列比对算法]BMC序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Bray,N.与Pachter,L.MAVID:ConstrainedAncestralAlignmentofMultipleSequences[MAVID：多个序列的约束祖使用MSA比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Lipman,DJ,等人A算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Corpet,F.,Multiplesequencealignmentwithhierarchialclustering[具有系统聚类法的多序列比对].Nucl.Acids对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Brudno,等人LAGANandMulti_LAGAN:efficienttoolsforlarge_scalemultiplealignmentofgenomicDNA.[LAGAN和Multi_LAGAN：基因组DNA大规模多重比对的有效工具]GenomeResearch[基个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Wheeler,T.J.与Kececiouglu,J.D.Multiplealignmentbyaligningalignments.[通过对齐比对进行多重比对]Proceedingsofthe15thISCBconferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology[第15届ISCB分子生物学智能系统会议纪要].Bioinformatics[生物信息学].23,i559_68,2007)。在实施例中，本公开涉及使用程序的PicXAA套件(包括但不限于PicXAA、PicXAA_R、PicXAA_Web等)计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Mohammad,S.,Sahraeian,E.和Yoon,B.PicXAA:greedyprobabilisticconstructionofmaximumexpectedaccuracyalignmentofmultiplesequences[多个序列的最大预期准确性比对的贪婪概率构建].NucleicAcidsResearch[核酸研究].38(15):4917_之间的百分比同一性(SZE,S._H.,Lu,Y.与Yang,Q.(2006)Apolynomialtimesolvableformulationofmultiplesequencealignment[多序列比对的多项式时间可解公式]涉及使用StatAlign比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Novák,A.等人(2008)StatAlign:anextendablesoftwarepackageforjointBayesian本公开涉及使用Needleman和Wunsch的Gap比对程序计算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Needleman和Wunsch,JournalofMolecularBiology[分子生物学杂志]算两个多核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性(Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics,[应用数学进展]2:482_489,1981,Smith等人,NucleicAcids通过共享相似序列的不同核酸或蛋白质之间的相似功能特知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链式反应(PCR)确定的，本发明的特定的核苷酸序列的变体将与该特定的核苷酸序列具有至少约40％、或抑制。启动子可以含有被转录因子识别的特定序列。这些因子可能与启动子DNA序列结包括TATABox、启动子序列、TFIIB识别元件和其他启动子基序(Jennifer,E.F.等人,(2002)Genes&Dev.[基因与发育],16:2583_2592)。上游启动子为RNA聚合酶II提供了作用[0078]上游启动子激活是通过各种蛋白质结合并随后与转录起始复合物相互作用以激翻译起始和mRNA输出中具有许多作用。另外，认为3'UTR包括聚腺苷酸化信CRISPR或TALEN)是非天然存在的蛋白质。设计和选择用于工程化DNA结合蛋白的方法的非标准。设计的合理标准包括应用取代规则和计算机算法，以处理数据库中存储现有ZFP、用以其全文并入本文。已知黄单胞菌属(Xanthomonas)的植物致病细菌在重要的作物植物细胞中注入的蛋白质超过了不同的效应子蛋白。在这些注射的蛋白质中有转录激活子样(TALEN)效应子，它们模仿植物转录活化因子并操纵植物转录组(参见Kay等人，(2007)充分的TAL效应子之一是来自疱病野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(参见Bonas等人,(1989)MolGenGenet[分子和普通遗传学]转录激活结构域(综述参见SchornackS等人，(2006)JPlantPhysiol[植物生理学]163指定brg11和hpx17已经发现与青枯雷尔氏菌生物变体菌株GMI1000和生物变体4菌株[0088]这些TAL效应子的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列包含约常位于位置12和13，并且似乎有位置12和13上的高变二残基的身份与TAL效应子的靶序列中连续核苷酸的身份之间的一种一一对应关系(参见Moscou和Bogdanove,(2009)Science胞中的非内源性报告基因表达的人工转录因子(Boch等人，同上)。工程化的TAL蛋白已与[0089]CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关的)核酸酶系统是疫”反应转化为CRISPRRNA(crRNA)。然后，该crRNA通过部分互补区域与另一种称为进行位点特异性DNA识别和切割。现在已经对该系统进行了工程化，以便可以将crRNA和行工程化，以指导Cas9或Cas12f1核酸酶靶向任何所希望的序列(参见Jinek等人,(2012)Science[科学]337,第816_821页，Jinek等人,(2013),eLife2:e00471和DavidSegal,crRNA同源的区域，以切割末端交错的DNA(参见Zetsche,Bernd等人,Cell[细胞]163.33379–303388；Dujon等人,(1989)Gene[基因]82:115_118；Perler等人,(1994)NucleicAcidsRes.[核酸研究]22,11127；Jasin(Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]263:163–180；Argast等人,(1998)Chevalier等人(2002)Molec.Cell[分子细胞]10:895_905；Epinat等人,(2003)NucleicAcidsRes.[核酸研究]531:2952_2962；Ashworth等人,(2006)Nature[自然]441:656_等人,(1978)Cell[细胞]15:579_85)；农杆菌属(Agrobacterium)介导的转移；直接DNA摄定转化，核酸片段稳定地整合入宿主生物体和任何后代的基因组中。含有经转化的核酸片该异源DNA为包括目的转基因/异源编码序列的核酸构建体；再生由该转基因/异源编码序入的DNA预期将被转移到接受包括目的转基因/异源编码序列的插入的DNA的后代中，得到从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。通常参见Mullis等人,ColdSpringHarborSymp.Quant.Bi[0096]如本文所使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸。在TaqMan8或菌复制起点的序列。术语“多接头”是指经由任何已知的无缝克隆方法(即GibsonAssembly8、NEBuilder例如，在分析程序的目的是检测细胞或组织中差异表达的转录物或多子(Storz,(2002)Science[科学]296:1260_3；Illangasekare等人,(1999)RNA5:1482_ (1998)TrendsBiochemSci.[生物化学科学趋势]23:25_29；和Gillet等人,(2001)Mol“内切核糖核酸酶_制备的siRNA(e_siRNA)”、“短发夹RNA(shRNA)”、和“小时序RNA 他合成核酸。领域普通技术人员所通常理解的相同含义。分子生物学中常用术语的定义可以在例如：Lewin,GenesV[基因V],OxfordUniversityPress[牛津大学出版社],1994(ISBN0_19_百科全书],BlackwellScienceLtd.[布莱克威尔科学有限公司],1994(ISBN0_632_02182_9)；和Meyers(编辑),MolecularBiologyandBiotechnology:AComprehensiveDeskReference,[分子生物学和生物技术：综合办公桌参考]VCHPublishers,Inc.,[VCH性或低遗传多样性。为了确定基因组的哪些区域被分类为高遗传多样性或低遗传多样性，已知包含高重组频率的区域。在进一步的方面，具有高重组频率的区域的重组率大于本公开比较了靶低多样性区域中26个公共大豆基因组组装体和10个内部大豆组装体的基genomeofwildandcultivatedsoybeans.[野生和栽培大豆的泛基因组]"Cell[细胞][0123]在实施例中，植物基因组整合位点包在其他实施例中，大豆植物基因组整合位点包含物理大小的大小范围为785,899bp至954,789bp的多核苷酸。在进一步的实施例中，大豆植物基因组整合位点包含物理大小为785,内的大豆植物基因组整合位点的靶位点对于供体多核苷酸的有效重组和位点特异性整合体多核苷酸的有效重组和位点特异性整合(SSI[0126]表1提供了Song,Qijian,等人“Constructionofhighresolutiongeneticlinkagemapstoimprovethesoybeangen组学]17.1(2016):1_11中所公开的常染色[0130]在实施例中，大豆植物基因组整合位点包含靠近数量性状基因座(QTL)的多核苷的基因组区域。QTL甚至可以包含在连续基因组区域或连锁群中的多个基因或其他遗传因作为可与本公开的调节元件可操作地连接的昆虫抗性编码序列的实施例，提供以下性状。和vip3Aa20。提供示例性鞘翅目昆虫抗性的编码序列包括：cry34Ab1(作为Herculex@销领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的除草剂耐受性编码序列的实施基因对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂具有进一步的活性)和aad_12基因(应注意aad_12基因基氨基_羰基_三唑啉酮类)的抗性基因是本领域已知的。这些抗性基因最通常是由点突变抗性的示例性基因包括过表达野生型拟南芥PPO酶(LermontovaI和GrimmB,(2000)OverexpressionofplastidicprotoporphyrinogenIXoxidaseleadstoresistancetothediphenyl_etherherbicideacifluorfen.[质体原卟啉原IX氧化酶的过表达导致对二苯醚除草剂氟锁草醚的抗性]PlantPhysiol[植物生理学]122:75–83.)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)PPO基因(Li,X.和NichollD.2005.DevelopmentofPPOinhibitor_resistantculturesandcrops.[PPO抑制剂抗性培养物和作物的开发]PestManag.Sci.[有害生物管理科学]61:277_285以及ChoiKW,HanO,LeeHJ,YunYC,MoonYH,KimMK,KukYI,HanSU和GuhJO,(1998)Generationofresistancetothediphenyletherprotoporphyrinogenoxidasegeneintransgenictobaccoplants.[通过在转基因烟草植物中表达枯草芽孢杆菌原卟啉原氧化酶基因来产生对二苯醚除草剂乙氧氟草醚的抗性]BiosciBiotechnolBiochem[生物科学生物技术生物化学]62:558–560)。吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮的抗性基因包括编码ACCase抑制剂的基因(例如Acc1_S1、Acc1_S2和作为可与本公开的调节元件可操作地连接的农艺性状编码序列的实施例，提供以下性状。pg基因提供的延迟的果实软化抑制了导致细胞壁中果胶分子分解的聚半乳糖醛酸酶的产的昼/夜生理过程。可以通过表达编码热稳定的α_的氨基酸组合物可以通过编码二氢吡啶二羧酸合酶的cordapA基因的表达而产生，该酶增盖任何农艺性状编码序列。将调节元件工程化到含有DNA结合基因的基因表达盒中。然后可将可操作地连接的序列掺列是本领域已知的。作为可与本公开的调节元件可操作地连接的DNA结合蛋白编码序列的[0142]可以靶向各种小RNA序列以插入本公开的基因组序列内。可以将调节元件工程化到含有小RNA序列的基因表达盒中。然后可将可操作地连接的序列掺入选择的载体中以允化合物可以由小RNA产生，如pPhL小RNA(降解PhL转录物以限制通过淀粉降解形成还原糖)引起的丙烯酰胺含量降低，该asn1小RNA触发Asn1降解从而损害天冬酰胺的形成并降低了[0144]可以靶向也被描述为报告基因的各种可选择标记以插入本公开的基因组序列Cloning:ALaboratoryManual[分子克隆：实验室手册],第三版,冷泉港出版社,纽约,这些除草剂的乙酰羟酸合成酶(AHAS)和乙酰乳酸合成酶(ALS)抗性/耐受性基因是熟知的。因(经由引入重组核酸和/或对天然EPSP基因进括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和绿产色链霉菌(Streptomyces赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸的抗性的示例性基因(包括吡氟氯禾灵、禾草灵、地可以修饰上述转基因/异源编码序列以在双子叶或单子叶植物中最佳表达。植物偏好性专利号6166302和美国专利号5380831(通过引用并入本文)中找例如通过聚合酶链式反应(PCR)检测大豆植物基因组内的基因表达盒。通过使用多态性的多态区段侧翼的两个寡核苷酸引物进行PCR检测，然后进行DNA扩增。该步骤包括DNA热变DNA序列中和一个在侧翼基因组序列中)在热稳定聚合酶和dNTP存在下循环。成功进行PCR用于检测扩增反应的这样的分子信标测定是本公开的因表达盒的多核苷酸的基因组DNA样品，使用聚合酶链式反应(PCR)为基础的测定(被称为KAspar@测定系统)筛选。在本公开的实践中使用的测定可以利用其中包含多个引物的KAspar@PCR测定混合物。PCR测定混合物中使用的引物可包含至少一种正向引物含有对应于基因组序列的特定区域的序列。用于检测扩增反应的这种KAspar②测定是本公开的一个实施例。料能够以流式细胞术可检测的浓度范围染色细胞DNA，并且具有可被实时热循环仪检测的定。可以使用具有合适的激发和发射光谱的任何合适的核酸染料，如YO-PRO-1、SYTOX和司(Roche)的基因组测序仪FLXTM，来自Solexa的IlluminaGenomeAnalyserTM和应用生物序(tSMS)和来自太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)的SingleMoleculeReal[0157]由454生命科学公司/罗氏公司销售的基因组测序仪FLXTM是长读PCR和焦磷酸测序来生成测序读段。可以使用300_800bp的DNA片段或含有3_20kb片段的文可逆终止子核苷酸通过合成方法并基于固相桥式PCR测序。可以使用含有最多10kbDNA片[0159]AppliedBiosystemsTM销售的寡核苷酸连接和检测测序(SOLiD)系统是一种短读[0160]HelicosBioscienceTM的tSMS和PacificBiosciencesTM的SMRT采用了不同的方组织、植物部分或植物细胞包含本公开的基因组序列或与选自SEQIDNO:1_109或SEQID因表达盒或与选自SEQIDNO:1_109或SEQIDNO:264_334的序列具有至少80％、81％、定掺入本公开的基因组序列或与选自植物的SEQIDNO:1_109或SEQIDNO:264_334的序[0166]本公开还涵盖上述大豆植物的栽培，其中该大豆植物具有转基因/异源编码序列或基因构建体，该转基因/异源编码序列或基因构建体含有整合在本公开的基因组序列内[0168]在实施例中，在大豆植物中表达至少一个转基因/异源编码序列的方法包括使大转基因/异源编码序列的方法包括培养大豆植物组织或大豆植物细胞，该大豆植物组织或大豆植物细胞包含作为供体多核苷酸整合在本公开的基因组序列内的转基因/异源编码序少一个转基因/异源编码序列的方法包括培养大豆植物组织或大豆植物细胞，该大豆植物组织或大豆植物细胞包含作为供体多核苷酸整合在本公开的基因组序列内的转基因/异源[0174]使用外源DNA的随机整合的传统转化方法将产生在基因组位点具有转基因的物物量等农业重要性状产生负面影响(Peng,T.,Sun,X.和Mumm,R.H.Optimizedbreedingstrategiesformultipletraitintegration:I.Min点与已知基因和调节区域的接近度以及整合所需的序列特征的存在来鉴定和细化该靶位[0182]为了简化遗传多样性评估，可以基于遗传或物理坐标和SNP组将植物品种的基因[0184]整合在具有上述特征的基因组整合位点内的转基因允许研究人员制定有效的渗单个区域中以形成复杂性状基因座的策略也是理想的(Gao,H.,Mutti,J.,Young,Yang,M.,Schroder,M.,LendeMaizeEnabledbyCRISPR_Cas9MediatedGeneInsertion.[CRISPR_Cas9介导的基因插入实现玉蜀黍中复杂性状基因座]FrontiersinPlantScience[植物科学前沿],11,[0187]步骤1：使用重新测序或通过高密度SNP基因分型平台对structureincommercialmaizebreedingprogramsinrelationtokeyfounderlines.[商业玉蜀黍育种计划中单倍型结构与关键创始系的关系]Theoreticaland高密度SNP谱创建的预定义单倍型的单倍型频率来评估遗传多样性。其他可靠的多样性度量包括_核苷酸多样性(Nei和Lei,1979年10月1日"MathematicalModelforStudyingGeneticVariationinTermsofRestrictionEndonucleases[根据限制性核酸内切酶研究遗传变异的数学模型]".PNAS.[美国国家科学院院刊]76(10):5269–73.)和单倍型多样性(NeiM(1987)Molecularevolutionarygenetics.[分子进化遗传学]ColumbiaUniversityPress[哥伦示例性区域包括Williams82基因组组装体w82.a2.v1的Chr02:4_9cM(1,169,882_2,124,671bp)和Chr01:13_20cM(1,69[0194]根据标准测序方案，制备45个大豆品种的全基因组鸟枪测序文库。在Illumina至少三个读段的覆盖，平均纯度>＝0.98。通过丢弃具有高水平缺失基因型的那些来进行点的读段比对对基因型进行评分。此后，使用FILLIN估算所有品系中缺失的基因型(Bradbury等人,2007TASSEL:softwareforassociationmappingofcomplextraitsindiversesamples[TASSEL：用于不同样品中复杂性状关联作图的软件],Bioinformatics[生物信息学],第23卷,第19期,2007年10月1日,第2633–2635页)。按照Coffman等人2020Haplotypestructureincommercialmaizebreedingprogramsinrelationtokeyfounderlines.[商业玉蜀黍育种计划中单倍型结构与关键创始系的关系]TheoreticalandAppliedGenetics[理论与应用遗传学],133(2),547_561所述的方ofhighresolutiongeneticlinkagemapstoimprovethesoybeangenome体Glyma1.01]BMCgenomics[BMC基因组学],17(1),1_11的共识[0198]Chr1上从约1,691,001延伸到2,476,900bp的区域(13_20cM)具有外源DNA插入的大豆组装体的已知主要结构变异不连锁(Liu等人2020Pan_genomeofwildand提供了Chr01:13_20的特征和物理[0203]Chr2上从约1,169,882延伸到2,124,671bp的区域(4_9cM)也具有外源DNA插入的ofwildandcultivatedsoybeans.[野生和栽培大豆的泛基因组]Cell[细胞],182(1),是是否否[0207]Chr1上从7,681,992延伸到35,921,482bp的区域(48_54cM)缺乏外源DNA插入的理thepalaeopolyploidsoybean.[古多倍体大豆的基因组序列]nature[自然],463(7278),2012Pericentromericeffectsshapethepatternsofdivergence,retention,andexpressionofduplicatedgenesinthepaleopolyploidsoybean.[近着丝粒效应塑造了古多倍体大豆中重复基因的趋异、保留和表达模式]ThePlantCell[植物细胞],2458％_62％_这一特征将限制供体和非供体之间在该区域的单倍型匹配并增加育种过程中近的转基因的有效渗入(Liu等人2020Pan_genomeofwildandcultivatedsoybeans.[0210]为了在大豆基因组中开发复杂性状基因座，开发了一种使用指导RNA/Cas9或Cas12f1核酸内切酶系统在目的大豆基因组基因座中引入转基因SSI(位点特异性整合)靶因组区域(也称为基因组窗口)以产生复杂性第一个大豆基因组窗口跨越1号染色体上的Chr01:1,730,000到Chr01:2,513,000窗口内的化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas核酸内切酶靶位点(52个位点)被鉴定为距任何已知基因的转录起始位点至少2_2.5kb并且距重复序列至少500bp，优选超过1kb[0215]用于开发复杂性状基因座(CTL)所选择的第二个大豆基因组窗口跨越2号染色体上的Chr02:1,117,000到Chr02:2,129,999。基因组窗口内的化脓链球菌