CN119431497A 靶向pd-l1蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用 （北京大学）

靶向PD-L1蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方本发明涉及靶向PD_L1蛋白的光敏剂嵌合体靶向PD_L1蛋白的多肽单元，所述光敏剂为卟啉类光敏剂，所述光敏剂的激发光波长>550nm；550nm波长以后的最大吸收波长处的摩尔吸光系其中所述连接臂的氨基侧与所述光敏剂单元相M。本发明的光敏嵌合体基于光降解PD_1/PD_L1中的PD_L1蛋白所诱发的免疫检查点阻断和细胞毒作用的联合治疗能够产生比单一治疗更强的免疫反应，在增强抗肿瘤治疗方面具有极大潜21.一种靶向PD_L1蛋白的光敏剂嵌合体，所述嵌合体为X_R_G结构，其中X为光敏剂单其中所述连接臂的氨基侧与所述光敏剂单元相连，所述连接臂(b)氨基酸序列(1)_(11)经过取代、缺失或增加1_3个氨基3进一步优选为dNdYdSdKdPdTd所述式I和式II中n独立为1_10的整数；G为靶向PD_L1蛋白的多肽单8.根据权利要求6所述的衍生化的光敏剂嵌合体的制备方法，步骤2)中所述第一偶联45靶向PD_L1蛋白的光敏剂嵌合体及其制备方法和应用[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向PD_L1蛋白的光敏剂嵌合体及兴治疗手段，并已应用于临床。近年来研究发现程序性死亡受体_1(programmeddeath疫相关的不良事件以及对肿瘤组织的摄取不良，还有逐渐发生的耐药性，这限制了PD_1/发免疫检查点阻断(ICB)治疗并结合以光动力治疗的细胞毒作用来开发设计分子是十分有67[0039]本发明对所述靶向PD_L1蛋白的多肽的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规Fmoc_D_Asn(Trt)_OH,Fmoc_D_Tyr(OtBu)_OH,Fmoc_D_Ser(tBu)_OH,Fmoc_D_Lys(Boc)_OH,Fmoc_D_Pro_OH,Fmoc_D_Thr(tBu)_OH,Fmoc_D_Asp(OtBu)_OH,Fmoc_D_Arg(Pbf)_OH,Fmoc_D_Gln(Trt)_OH,Fmoc_D_His(Trt)_OH,Fmoc_D_P)y_8[0052]附图2为应用等离子共振技术测定实施例1制备得到的靶向PD_L1蛋白的多肽[0053]附图3为实施例1制备得到的光敏剂嵌合体(PPA_VPF)同分异构体的LC_MS谱图(分[0054]附图4为实施例1制备得到的光敏剂嵌合体(PPA_VPF)与维替泊芬(VPF)的紫外吸[0056]附图6为实施例1制备得到的光敏剂嵌合体在红光照射后用捕获剂Tempo捕获后的[0057]附图7为应用等离子共振技术测定实施例1制备得到的光敏剂嵌合体和蛋白hPD_L[0058]附图8为不同浓度下实施例1制备得到的光敏剂嵌合体对活细胞表面的PD_L1蛋白[0059]附图9为活细胞表面的PD_L1蛋白激光共聚焦成像结果(蓝色代表细胞核；绿色代[0061]附图11为a)光降解靶向嵌合体PPA_VPF经660nm激光以100mW/cm2的光照射(5min×2)后的细胞毒性；b)不同细胞中加入实施例1制备得到的光敏剂嵌合体PPA_VPF或VPF避[0062]附图12为不同时间点下光敏剂VPF和实施例1制备得到的光敏剂嵌合体PPA_VPF的9[0063]附图13为光敏剂VPF(30min)和实施例1制备得到的光敏剂嵌合体PPA_VPF(24h)的[0073]向多肽合成管中称取一定量负载有Fmoc_NH2的树脂(Fmocloading:0.37mmol/g,[0077]用于多肽合成的αN_Fmoc或αN_Boc保护的非天然d型氨基酸包括：Fmoc_d_Asn(Trt)_OH,Fmoc_d_Tyr(OtBu)_OH,Fmoc_d_Ser(tBu)_OH,Fmoc_d_Lys(Boc)_OH,Fmoc_d_Pro_OH,Fmoc_d_Thr(tBu)_OH,Fmoc_d_Asp(OtBu)_OH,Fmoc_d_Arg(Pbf)_OH,Fmoc_d_Gln(Trt)_OH,Fmoc_d_His(Trt)_OH,Fmoc_[0080]使用高效液相色谱进行多肽产物的分析及GEHealthcare)进行测量。商业购买的hPD_L1在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5，GEHealthcare)中稀释，最终得到40μg/mL的蛋白质浓度。使用标准胺偶联试剂盒(GEHealthcare)，通过伯胺基团将稀释的hPD_L1共价固定到新传感器芯片(S系列传感器芯片活化氨基酸后将该混合溶液加入到装有制备例1制备PPA多肽的合成树脂的多肽合成管中，在摇床上反应过夜至偶联完成。继续使用20％哌啶的DMF溶液脱除(5min×2)连接臂上的Fmoc保护基，之后用DMF(×3)、DCM(×3)、DMF(×3)洗涤。将维替泊芬Verteporfin[0092]使用高效液相色谱进行多肽产物的分析及分离，得到光敏剂嵌合体(PPA_VDF，[0094]hPD_L1蛋白与光敏剂嵌合体之间的亲和力通过表面等离子共振(SPR，Biacore8k，GEHealthcare)进行测量。商业购买的hPD_L1在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5，GEHealthcare)中稀释，最终得到40μg/mL的蛋白质浓度。使用标准胺偶联试剂盒(GEHealthcare)，通过伯胺基团将稀释的hPD_L1共价固定到新传感器芯片(S系列传感器芯片GEHealthcare)流速30μL/min进行测量。为了获得动力学和亲和力分析的数据，将PPA_[0100]利用LC_MS表征条件：AgilentC18分析色谱柱，洗脱梯度为30min内流动相B从[0101]PPA_VPF:保留时间为18.68min和20.06min。ESI_MS：Calculatefor测定其在两种溶剂中的荧光发射光谱，以光敏剂维替泊芬作为对照。结果如附图5所示。PPA_VPF的最大发射波长与维替泊芬本身一致。在不同溶剂中所展示的荧光强度与上述的[0107]PPA_VPF以及维替泊芬VPF在被光激发后产生的ROS被自旋捕获剂4_羟基_2,2,6,[0111]蛋白质靶向光降解解采用westernblot进行分析。为了在活细胞中进行分析，将身、纯多肽或DMSO作为对照在37℃下处理细胞8小时，然后用300W氙弧灯(600nm带通滤波器，1.5mW/cm2)照射细胞。细胞在含有蛋白酶_磷酸酶抑制剂混合物(#87786，ThermoFisherScientific)的RIPA裂解缓冲液(P0013B，BeyotimeBiotechnology)中在4℃下裂解30分钟，并通过细胞刮片收集。将收获的总蛋白质在12％聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS_PV_2在细胞层面可以成功的实现PD_L1的靶向的选择析。结果如附图10所示，其中阴性对照组(即Blank组)瘤部位荧光强度较高而其余部位荧光强度较低的时间点，选定VPF30min和PPA_VPF24h，[0129]选择双侧肿瘤模型实验方法开展体内抗肿瘤研究。将4T1细胞(5×105)皮下注射PPA_VPF的剂量为2mg/kg，其他组按照与实验组等物质的量进行换算。VPF组在注射后[0131]利用HE切片染色对小鼠的肿瘤组织进行病理学检验。使用4％多聚甲醛溶液对离[0133]为了进一步验证降解PD_L1蛋白以及联合光动力疗法对远端肿瘤的免疫治疗作述结果均证实，设计的光降解靶向嵌合体PPA_VPF在协同光动力和PD_1/PD_L1的免疫治疗[0136]将4T1细胞(5×105)皮下注射到BALB/c小鼠的左侧。当肿瘤体积达到300mm3左右鼠经注射后30min和24h以500mW/cm2的强度660nm激光照射8分钟。避光饲养，给药后第三添加抗体(抗小鼠CD3_FITC、抗小鼠CD4_APC、抗小鼠CD8_PE_Cy7和抗小鼠IFN_γ_PE，(如附图17b)也类似，单独多肽PPA组或单独的光动力疗法的治疗(即VPF组)能够部分提高导最