CN119438590A 一种活细胞内原位标记溶酶体蛋白质的方法及所用试剂 （北京大学）

一种活细胞内原位标记溶酶体蛋白质的方本发明公开了一种活细胞内原位标记溶酶胞内原位标记溶酶体蛋白质的方法包括：利用21)利用Eosin_N2与硫代亚甲基醌前硫代亚甲基醌前体探针由连接基团连接生物素与式III所示硫2)用绿光照射所述Eosin_N2与探针处理后的2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：硫代亚甲基醌前体探针为式II所示化合1b)利用硫代亚甲基醌前体探针处理所述Eosin_N2处理后的细胞，得到Eosin_N2与探M1)富集细胞内溶酶体蛋白质的方法，包括：利用权利要求1_5中任一所述方3M2)式I所示Eosin_N2的制备方法，包括：将Eosin_NHS与二(2_吗啉基乙基)胺进行反X1)原位标记细胞内溶酶体蛋白质；X3)富集细胞内溶酶体蛋白质；4蛋白酶、核酸酶、糖苷酶等)和位于膜上的蛋白质复合物(如v_A[0003]然而，由于整个细胞内溶酶体蛋白的丰度较低(约0.2％)(eLife,2016,5,够在活细胞中标记亚细胞区域的蛋白质组，被认为是原位蛋白质组学研究的理想方案[0005]本发明所要解决的技术问题是如何在活细胞内原位标记溶酶体蛋白的非酶化学5[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了细胞内原位标记溶酶[0009]硫代亚甲基醌前体探针由连接基团连接生物素与式III所示硫代亚甲基醌前体得[0017]1b)利用硫代亚甲基醌前体探针处理所述Eosin_N2处理后的细胞，得到Eosin_N26[0024]硫代亚甲基醌前体探针处理所述Eosin_N2处理后的细胞可在能使所述待测细胞素琼脂糖凝胶珠(Agrosebeads)或5_dioxopyrrolidin_1_yl)_3',6'_diacetyloxy_2',4',5',7'_tetrabromo_1_oxospiro[0030]具体的，式I所示Eosin_N2的制备方法可包括Eosin_N2的合成：向Eosin_NHS(18mg，0.02mmol)的DCM(二氯甲烷)溶液(2mL)中搅拌添加二(2_吗啉基乙基)胺化合物1b缩，即得到粗混合物。将粗混合物通过SiO2凝胶快速色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1洗[0031]本发明还提供了一种产品，所述产品含有所述Eosin_N2和/或所述硫代亚甲基醌7[0037]所述产品，或式I或式II所示的化合物的下述任一应用，也属于本发明的保护范况为直接目的，也可以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目8[0052]图5为HeLa细胞的溶酶体标记蛋白质组学数据分析。本方法表示本发明的活细胞[0054]图7为RAW264.7细胞的溶酶体标[0056]图9为Raji细胞的溶酶体标记蛋白质组学数据分析。本方法表示本发明的活细胞[0057]图10为HeLa细胞加减rapamycin刺激前后溶酶体蛋白组学变化分析。本方法表示[0058]本发明提供的活细胞内原位标记溶酶体蛋白质及标记效果的检测步骤如图1所(主要目的是去除贴壁细胞培养过程中漂浮的死细胞，如果是悬浮细胞则用离心的方式洗涤)；[0060]2)在待测活细胞中加入含有Eosin_N2的培养基溶液(Eosin_N2浓度一般在微摩尔[0061]3)将步骤2)中孵育后的待测活细胞用DMEM培养基洗涤三次(对于贴壁细胞，直接在培养皿中换液洗涤；对于悬浮细胞，则通过离心_弃去上清液_加培养基重悬的方式洗[0063]5)再通过换液的方式用含有硫代亚甲基醌前体探针的无酚红DMEM高糖培养基对源520nm对细胞进行15分钟的照射(培养皿上方覆盖一个冰盒，目的是降温，保持细胞状9[0064]6)将步骤5)中光照后的待测活细胞在培养箱(37℃,5％二氧化碳)[0067](2,5_dioxopyrrolidin_1_yl)_3',6'_diacetyloxy_2',4',5',7'_tetrabromo_1_oxospiro[2_benzofuran_3,9'_xanthene]_5_carboxylate)按照文献(Y.Li,M.B.Aggarwal,K.Nguyen,K.Ke,R.C.Spitale,Acs.Chem.Biol.2017,12,2709_2714.)中DBF请CN110922437A中二(2_吗啉基乙基)胺)的制备步旋蒸，粗品经过柱层析纯化得到油状二(2_吗啉基乙基)氨基甲酸叔丁酯1.25g，产率为42%;酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干即可得到化合物5胺盐酸盐，安耐吉化学产品，货号为A010938)(263mg)，HOBt(1_羟基苯并三唑，Adamas下搅拌1h。1h后，用注射器加入DMF稀释的Biotin_PEG2_NH2(毕得医药产品，货号为(santacruzbiotechnology产品，货号sc_101339)与Actin抗体(中杉金桥产品，货号TA_biotin免疫印迹信号明显强于对照组，表明本发明能够有效地在HeLa细胞中标记到蛋白丰度与全细胞蛋白质组的溶酶体蛋白丰度(参考文献eLife,2016,5,e16950)比较图。可以中有122个已知溶酶体蛋白，比例达到42％。而全蛋白质组数据库中溶酶体蛋白比例仅于四盘10cm培养皿中培养(DMEM培养基，含10％胎牛血清)待细胞长满，得到待检测的据中的蛋白数量统计，表明本发明的方法最终鉴定到的蛋白质组中有89个已知溶酶体蛋白，比例达到44％。而小鼠全蛋白质组数据库中溶酶体蛋白比例仅3.6％(全蛋部分用于蛋白质谱组学分析，以鉴定所标记的蛋白质并进行检测组和对照组间的相对定biotin免疫印迹信号明显强于对照组，表明本发明能够有效地在Raji细胞中标记到蛋白的蛋白列表中，溶酶体蛋白的质谱信号总强度与所有蛋白的质谱信号总强度的比值。图9天将加药组细胞用100nM的rapamycin(雷帕霉素)处理(提前处理24h)，非加药组则用同等胶珠对所标记的溶酶体蛋白质组进行富集纯化。富集所得的蛋白用于蛋白质谱组学分析，影响Eosin_N2对于溶酶体蛋白质的捕捉(加药Eosin_N2处理组，加药非Eosin_N2处理组)，2明的方法鉴定到蛋白质的溶酶体特异