第47讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

第47讲基因工程的基本工具和基本操作程序核心考点考题统计考情分析1.基因工程的基本工具2025·江苏卷T19

2024·湖南卷T52023·湖北卷T42023·重庆卷T121.命题特点：常以科研案例、生产或医学治疗为情境，结合免疫学应用、微生物培养、胚胎工程、遗传学、生理学等内容考查理解能力与实验探究能力。2.备考重点：掌握限制酶的作用与选用、表达载体的构建与转化、PCR技术与基因的获取及转基因的检测与鉴定、操作技术原理，外源基因表达及基因编辑等2.基因工程的基本操作程序2025·安徽卷T15

2025·河南卷T212025·黑吉辽蒙卷T25

2025·广东卷T212025·山东卷T252025·陕晋青宁卷T212025·四川卷T19

2025·甘肃卷T212025·浙江1月选考T24

2025·湖南卷T21

2025·河北卷T222025·安徽卷T20核心考点考题统计考情分析3.DNA的粗提取与鉴定2025·江苏卷T232024·安徽卷T142024·山东卷T132023·广东卷T112023·福建卷T41.命题特点：常以科研案例、生产或医学治疗为情境，结合免疫学应用、微生物培养、胚胎工程、遗传学、生理学等内容考查理解能力与实验探究能力。2.备考重点：掌握限制酶的作用与选用、表达载体的构建与转化、PCR技术与基因的获取及转基因的检测与鉴定、操作技术原理，外源基因表达及基因编辑等4.DNA片段的扩增和电泳鉴定2025·全国卷T62025·全国卷T342025·湖南卷T212025·河北卷T15考点二基因工程的基本操作程序考点三DNA的粗提取和DNA片段的扩增与电泳鉴定考点一基因工程的基本工具目录CONTENT高考真题感悟课时跟踪检测考点一基因工程的基本工具1.

基因工程的概念教材拾遗：〔选择性必修3

P68“科技探索之路”〕肺炎链球菌的转化实验

不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物的不同个体之间

转移；科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以

在细菌细胞间转移；多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的

切割、连接以及功能基因的获得创造了条件；基因组编辑技术可以实现对

特定基因的定点插入、敲除或替换。2.

基因工程的基本工具（1）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”提醒：一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末

端或平末端。（2）DNA连接酶——“分子缝合针”教材拾遗：〔选择性必修3

P72“旁栏思考”〕DNA连接酶和DNA聚合酶

不是一回事。①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把

单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要

以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。（3）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

1.

通过基因工程技术引入外源基因可改变中国水仙花色。（2024·福建

卷）

（

√

）2.

使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。（2024·贵州卷）

（

√

）3.

已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某

种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一

定至少有3个被该酶切开的位置。（2020·浙江卷）

（

√

）√√√4.

将目的基因导入植物细胞可采用噬菌体作为载体。〔选择性必修3

P73

正文〕

（

×

）提示：应采用植物病毒或质粒作为载体。×

1.

根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类（1）应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。（2）不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。（3）为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限

制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶

（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。2.

根据质粒的特点确定限制酶的种类3.

根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取（切割目的基因的

限制酶为XbaⅠ和SacⅠ），分析如下：4.

巧用“同尾酶”：不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割

后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。当不适合选择某种限制酶时，

可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。

考查基因工程所需限制酶和DNA连接酶1.

（2025·江苏高考19题改编）图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind

Ⅲ切割位点。Alu

Ⅰ限制酶识别序列及切割位点为

，下

列相关叙述正确的有（

）A.

基因A突变为a是一种碱基增添的突变B.

用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型相同C.

用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致D.

产前诊断时，该致病基因可选用Hind

Ⅲ限制酶开展酶切鉴定√解析：由图可知，基因A突变为基因a，是由于T—A替换成了G—C，属于碱基对的替换，A错误；HindⅢ切割后形成的是黏性末端，AluⅠ切割后形成的是平末端，B错误；突变后的基因a中间片段不存在HindⅢ的切割位点，存在AluⅠ的切割位点，基因a分别用HindⅢ和AluⅠ酶切后产生的片段大小不一致，C错误；正常的基因A用HindⅢ酶切后产生4个片段，突变

后的基因a用HindⅢ酶切后产生3个片段，D正确。题后归纳：与DNA有关的几种酶的比较考查载体的作用及特点2.

（2023·新课标卷6题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（

）A.

质粒和目的基因都用酶3切割，用E.

coli

DNA连接酶连接B.

质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4

DNA连接酶连接C.

质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4

DNA连接酶连接D.

质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.

coli

DNA连接酶连接√解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4

DNA连接酶连接效率更高，A项错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B项错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4

DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C项正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D项错误。3.

〔经典高考题改编〕表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标

记基因、

和

等。

DNA重组技术中所用的质粒载体具

有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中

能

；质粒DNA分子上有

，便于外源DNA

插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生

素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是

⁠

⁠。启动子

终止子

自我复制

限制酶切割位点

将待筛选的宿主细胞接种到

含该抗生素的培养基中，能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞解析：基因表达载体除复制原点、目的基因、标记基因外，还必须有启动

子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它

们分别位于目的基因的上下游。作为载体的质粒DNA分子上必须有复制原

点，才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制；质粒DNA分子上应有一个

至多个限制酶切割位点，利于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基

因，可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞，以

达到筛选目的。考点二基因工程的基本操作程序1.

目的基因的筛选与获取（1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或

获得预期表达产物等的基因。主要是指

的基因。（2）筛选合适的目的基因①从相关的已知

⁠清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法

之一。②利用

和序列比对工具进行筛选。编码蛋白质

结构和功能

序列数据库

（3）获取目的基因的方法①人工合成目的基因a.逆转录法：已知目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以以目的

基因的mRNA为模板，借助

酶合成双链DNA。b.化学合成法：已知某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后

直接合成目的基因。②

⁠获取和扩增目的基因③通过构建

来获取目的基因。逆转录

PCR

基因文库

2.

基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）目的：使目的基因

⁠

，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）基因表达载体的组成在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一

代

（3）构建过程提醒：

区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子教材拾遗：〔选择性必修3

P80“图3-6”〕不能将目的基因插入载体的标

记基因中的原因是标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以

便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记

基因被破坏，无法进行筛选。3.

将目的基因导入受体细胞（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持

⁠

的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相

同，从变异的角度分析都属于

⁠。稳定和

表达

基因重组

（2）不同受体细胞导入方法不同（3）农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入提醒：（1）花粉管通道法受体细胞是受精卵，农杆菌转化法受体细胞是

体细胞。（2）导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA

上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他

作物中，造成“基因污染”。前联后挂：（1）农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细

胞，但基因工程最终要的是转基因植株，如何实现这一目标：得到含有目

的基因的植物细胞后进行植物组织培养。（2）研究人员将两个抗虫基因（T）导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。

两个抗虫基因在染色体上随机整合有如图所示情况，其自交后代表型及比

例分别是多少？甲自交子代全为抗虫；乙自交子代抗虫∶不抗虫＝3∶1；丙自交子代抗虫∶不抗虫＝15∶1。4.

目的基因的检测与鉴定（1）方法（2）检测转基因生物染色体上是否插入目的基因方法1：PCR等技术（图中M：marker；1：阳性质粒；2：原始品系；3～9：成功插入目

的基因）①原理：DNA-DNA碱基互补配对。②基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱

基互补配对，并带有

标记或荧光标记。放射性同位素

方法2：DNA分子杂交技术出现

，说明目的基因已插入受体细胞的DNA中。杂交带

③过程：（3）检测目的基因是否转录方法1：PCR等技术提取培育出的转基因植株细胞中的RNA，依据目的基因两端的特异性序列

设计两种引物，对转基因植物细胞中的DNA进行RT-PCR扩增。对扩增产

物进行电泳鉴定。方法2：分子杂交技术①原理：DNA-RNA碱基互补配对。②过程：（4）检测目的基因是否翻译出蛋白质①方法：抗原—抗体杂交技术。②原理：

⁠。③过程：提取转基因植物的蛋白质（作为抗原）＋相应抗体→是否出现杂

交带。抗原—抗体特异性结合

前联后挂：胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，

也可与胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子。人体的细胞中，胰岛

B细胞的DNA和mRNA能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中

只有DNA能与之形成杂交分子。

1.

将质粒DNA进行酶切时，发现DNA完全没有被酶切，原因是酶切条件

不合适，可通过调整反应条件，如温度和酶的用量等。（2024·湖南卷）

（

×

）提示：调整酶的用量没有作用。2.

启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。（2023·全国

乙卷）

（

×

）提示：启动子驱动基因转录。××3.

构建基因表达载体是基因工程的核心工作。〔选择性必修3

P80正文〕

（

√

）4.

Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因进入宿主细胞，并可将目的基因整合

到该细胞的染色体DNA中。〔选择性必修3

P81资料卡〕

（

√

）√√

构建基因表达载体的过程分为酶切和连接两个步骤。下图为构建基

因表达载体时所用的载体及目的基因所在DNA片段上限制酶的识别切

割位点情况。（1）选择SpeⅠ进行单酶切构建基因表达载体时，容易出现目的基因和载

体的自身环化，以及目的基因的反向连接，导致目的基因转录时

⁠

出现错误，无法表达正常的蛋白质。（2）选择BamHⅠ与BglⅡ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单

酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向连

接？为什么？提示：不能，因BamHⅠ与BglⅡ虽然识别序列不同，但切割后产生的黏性

末端相同。模板

链

（3）选择BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切构建基因表达载体时，能否避免单

酶切时出现的目的基因和载体的自身环化，以及目的基因的反向连接？为

什么？提示：能，因BamHⅠ与HindⅢ切割后产生的黏性末端不同。

1.

正向连接与反向连接的检测（1）电泳检测使用两种不同的限制酶对重组质粒进行切割，根据理论分析得到酶切产物的大小并进行琼脂糖凝胶电泳分析。如果目的基因插入方向正确，将出现预期的酶切产物大小。如果目的基因插入方向不正确，电泳后将出现另外一组大小不同的产物。

研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示）：问题探讨：经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到

的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶

和BamHⅠ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。（2）利用PCR进行检测方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增。2.

影印法筛选含有目的基因的受体细胞（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，破坏某

一抗生素抗性基因，保留另外一个抗性基因。如图，目的基因插入了四环

素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含

质粒的细菌。（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的

是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利

用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、

4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5

菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

1.

（2025·安徽高考15题）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入

大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色

菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人

源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（

）考查基因工程的基本流程A.

使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和

蓝色菌落数B.

如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基

因的菌株C.

因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标

蛋白的菌株D.

若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导

入了大肠杆菌√解析：

基因工程图像分析氯化钙处理大肠杆菌能增强其对质粒的摄取能力，使更多大肠杆菌获得质粒，提高其转化效率。若获得空载质粒（β-半乳糖苷酶基因未被破坏），则会在筛选平板上形成蓝色菌落；若获得重组质粒（人源干扰素基因的插

入会破坏β-半乳糖苷酶基因），则会在筛选平板上形成白色菌落。因此，使用氯化钙处理可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；若筛选平板中仅含卡那霉素，能在上面形成白色菌落的菌可能是导入目的基因的大肠杆菌，也可能是对卡那霉素有抗性的杂菌，B正确；筛选平板中长出白色菌落，只能说明菌株中导入了β-半乳糖甘酶基因被破坏的质粒，但该质粒中是否正确连接目的基因，且目的基因是否转录、翻译，是否表达出目标蛋白未知，还需要进一步鉴定，C错误；质粒K经过BamH

Ⅰ酶切后，若未与目的基因连接，其可能是自身环化重新形成完整质粒，导入大肠杆菌后，β-半乳糖苷酶基因正常表达，分解X-gal产生蓝色物质，形成蓝色菌落，D正确。2.

（2025·四川高考19题）杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临

床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进

入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA—lrcF）导入链霉

菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引

物5-3方向。②密码子对应的氨基酸：AAA-赖氨酸；AUG-甲硫氨酸（起

始）；UUC-苯丙氨酸；ACA-苏氨酸：UCG-丝氨酸。（1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA—lrcF目的基因时，应选

用

引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是

⁠

⁠。解析：引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA—lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体能在链霉菌细胞中复制，也使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。F2、F4

保

证载体能在链霉菌细胞中能正常复制

（2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝

胶电泳检测应产生

条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是

⁠

⁠。解析：采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功，但还需要进一步的鉴定。2

验证

重组质粒是否构建成功

（3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带

⁠

（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致

，最

终引起细菌死亡。苯丙氨酸（或

phe）

翻译受阻

解析：观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。（4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室

多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是

⁠

。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物

活性外还需进一步研究的问题有

（答出1点即可）。解析：重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有：优化发酵条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。目的基

因发生突变或变异

发酵条件优化

考点三DNA的粗提取和DNA片段的扩增与电泳鉴定1.

DNA的粗提取与鉴定（1）基本原理（2）实验步骤2.

DNA片段的扩增与电泳鉴定（1）实验基础（2）利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增DNA片段教材拾遗：〔选择性必修3

P77“相关信息”〕真核细胞和细菌的DNA聚

合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物

是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（3）PCR实验的操作步骤提醒：（1）在PCR过程中实际加入的原料为dNTP（即dATP、dGTP、

dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供

能量。（2）复性温度过高，则引物难以与模板链结合；温度过低则易使两条母

链配对结合，均无法获得PCR产物。（3）在“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验中，防止DNA被污染的操

作：为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头

和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理；在向微量离心管中添加

反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂

的污染；在进行操作时，一定要戴好一次性手套。（4）DNA的电泳鉴定提醒：（1）DNA分子在缓冲液中带负电荷，点样时点在负极使DNA向正

极移动。（2）DNA分子的相对分子量越大，电泳时的迁移速率越慢；DNA的相对

分子量越小，电泳时迁移速率越快。

1.

DNA的粗提取与鉴定用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。

（2025·湖南卷）

（

×

）提示：猪成熟红细胞中无DNA。2.

在提取的DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后观察颜色以鉴定

DNA。（2025·河北卷）

（

√

）3.

配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。

（2024·河北卷）

（

×

）提示：应加入4种dNTP作为原料。×√×4.

利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结

果。（2024·河北卷）

（

√

）5.

PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。

（2022·辽宁卷）

（

×

）提示：DNA复制需要引物。6.

粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4

℃冰箱中进行是为了防止DNA降

解。（2022·山东卷）

（

√

）7.

动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。（2022·湖北卷）

（

×

）提示：DNA的提取不需无菌环境。√×√×

根据PCR反应过程示意图分析下列问题：（1）PCR技术为什么需要引物？提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸DNA链。（2）利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？提示：目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。（3）为扩增目的基因，应选择下图所示引物中的

⁠。引物Ⅱ和引物Ⅲ

（4）某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如

图），请分别说明理由。①第1组：

⁠；②第2组：

⁠。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效

引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

（5）为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总

RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地

扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？提示：引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或引物能与Wx基

因的cDNA特异性结合）。（6）若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引

物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？提示：经过n轮循环需要消耗引物数为（2n＋1－2）个，第n轮循环需要消

耗的引物数为2n个。

PCR引物的设计、修饰和计算（1）PCR引物的设计原则①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23

bp。过长会导致其延伸温度

大于74

℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致

引物与模板链随机结合。②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免

形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避

免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。（2）引物与复性温度①复性温度：复性温度偏高，引物不能与模板很好地复性，扩增特异性

强，扩增效率低；复性温度偏低，引物将产生非特异复性，导致非特异性

的DNA片段的扩增，扩增效率高。②引物：ⅰ.引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当

提高复性温度；ⅱ.引物GC含量越高，变性温度也越高。（3）引物的修饰①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点；引入启动子

序列、插入突变序列等。（4）PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A（或B）的

DNA分子数1372n－1同时含引物A、B的

DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2

考查DNA的粗提取与鉴定1.

（2024·安徽高考14题）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，

错误的是（

）A.

实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B.

利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D.

将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白

质杂质√解析：

研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降

低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可

初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化

而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸

水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，

D错误。2.

（2023·福建高考4题）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验Ⅰ）

和“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅱ）的实验操作，下列相关叙述正确的

是（

）A.

实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌

处理B.

实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源C.

实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的

DNAD.

实验Ⅱ中，将白色丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴，用于

鉴定DNA√解析：实验Ⅰ中，PCR实验所需的枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，A错误；实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，应先加样后接通电源，B错误；实验Ⅱ中，取洋

葱研磨液的上清液，由于DNA不溶于酒精溶液，加入等体积冷酒精后析出

粗提取的DNA，C正确；实验Ⅱ中，将丝状物溶于2

mol/L的NaCl溶液后加

入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用于鉴定

DNA，D错误。考查DNA片段的扩增与电泳鉴定3.

（2025·全国卷6题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4

的电泳结果如图所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已

知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位

点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（

）A.

配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液B.

该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷C.

甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同D.

据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物√解析：配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向“＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、构象、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。4.

（2025·全国卷11题）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题：（1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复

制时解开双链的酶是

，而PCR过程中解开双链的方法是

⁠

⁠。解旋酶

高温

变性

解析：在细胞中，DNA复制时解开双链的酶是解旋酶。而在PCR过程中，是通过高温变性（加热至90～95

℃）的方法使DNA双链解开。（2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有

⁠

⁠。解析：PCR过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导DNA聚合酶合成新的DNA链，dNTP脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的DNA链提供原料。引

物、脱氧核苷三磷酸（dNTP）

（3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作

用是：

⁠；②无扩增产物，原因是

⁠；作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是

⁠

⁠。管号①②③④⑤⑥模板无P0Px无P0Px引物对引物1和引物2引物3和引物4目的基因、质粒片

段、含目的基因和部分质粒序列的片段解析：实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响（或鉴定反应体系中是否有模板污染）。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的DNA片段；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段DNA片段；⑥以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的DNA片段。（4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期

结果

⁠

⁠。解析：实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生

成。有产物生成，则证明酶X有活性高考真题感悟一、命题角度练角度一以基因工程的基本工具为核心，考查生命观念、科学思维1.

（2024·湖南高考5题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA

完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是

（

）A.

限制酶失活，更换新的限制酶B.

酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C.

质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD.

酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶√解析：

限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，

A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和

pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别

位点缺失，进而造成限制酶无法对质粒DNA进行切割，此时应更换为正常

质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲

基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制

酶，D正确。2.

（2025·江西高考11题）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构

建了含有抗病基因D的重组Ti质粒（如图），通过农杆菌转化法将D基因导

入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（

）A.

水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶

无法识别U6启动子B.

在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启

动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达C.

农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素D.

愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株角度二以基因工程的操作程序及实验为情境，考查科学思维与科学探究√解析：

将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因

表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻

愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别，A错误；启动子是一段有特殊序列结构

的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能

够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质

粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉

素抗性基因的表达，B正确；愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素，C错误；检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株，D错误。3.

（2023·山东高考25题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质

粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标

签短肽V5。（1）与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构

外，作为载体，质粒还需具备的结构有

⁠

（答出2个结构即可）。RNA聚合酶

限制酶切割位点、标记基因、复

制原点等

解析：基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始位点。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需

进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

⁠

。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因

的

（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。F2和R1或F1和

R2

a链

解析：据图甲可知，引物F2和R1和F1和R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检

测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1和R2。b是模板

链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3'←5'，非模板链（也就是a链）是5'→3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5'→3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'→3'，所以引物结合的单链其方向是3'←5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3'←5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别

检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带

1证明细胞内表达了

，条带2所检出的蛋白

（填

“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。J-V5融合蛋白

不是

解析：据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。4.

（2024·黑吉辽高考7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实

验，下列叙述正确的是（

）A.

琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.

凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.

在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D.

琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来角度三以DNA的粗提取与鉴定、PCR及电泳为情境，考查科学探究√解析：应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8％～1.2％的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段（带负电）越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300

nm的紫外灯下被检测出来，D错误。二、长句表达练5.

（2024·全国甲卷38题节选）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受

体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是

⁠

。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期

结果是

⁠

⁠

⁠

⁠。能吸收周围环境中DNA分

子

将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的

DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组

DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒（合

理即可）

课时跟踪检测1.

（2025·陕西汉中模拟）质粒是基因工程中常用的一种载体。下列关于

质粒的说法，错误的是（

）A.

质粒中的嘌呤碱基数和嘧啶碱基数是相等的B.

一些质粒可以整合到目的细胞的染色体上，随受体DNA同步复制C.

可以利用质粒上的特殊标记基因对目的基因进行筛选D.

质粒至少应有三个限制酶识别切割位点，便于目的基因插入123456789√解析：质粒是小型环状双链DNA，双链DNA中，A＝T、G＝C，因此A＋G＝T＋C，即嘌呤碱基数等于嘧啶碱基数，A正确；基因工程中的载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，以便提供大量的目的基因，B正确；质粒上需要具有某些特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选，C正确；质粒一般具有一个至多个限制酶切割位点，以供目的基因插入其中，D错误。1234567892.

（2023·广东高考11题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂

解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（

）A.

裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.

分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.

沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.

鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色√123456789解析：裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。1234567893.

（2025·辽宁沈阳模拟）农杆菌转化法是植物转基因技术中常用的转化

方法之一。下列与该方法相关的叙述，错误的是（

）A.

农杆菌是重组质粒的受体细胞B.T-DNA是拟核DNA上的一段序列C.

农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物D.

新鲜叶圆片与农杆菌在适宜条件下共培养，部分细胞会被转化√123456789解析：将目的基因与载体相连形成重组质粒后，要导入土壤农杆菌内，再让农杆菌去侵染植物细胞，A正确；T-DNA是位于Ti质粒中的一段序列，不位于拟核，B错误；农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，C正确；农杆菌转化法的转化效率不是100％，因此适宜条件下，新鲜叶圆片与农杆菌共培养后，部分细胞会被转化，D正确。1234567894.

（2025·广东梅州联考）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无

严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）

是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（

）A.

图示环节所需的温度比上一个环节的低B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端C.

Taq

DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成D.

经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同√123456789解析：图中环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度（50

℃左右）比变性的温度（90

℃以上）低，A正确；在PCR扩增中，子链延伸的方向是从5'端到3'端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B正确；Taq

DNA聚合酶能催化磷酸二酯键的形成，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不一定相同，一般PCR第三轮才可以扩增出双链脱氧核苷酸数量相同的子代DNA，D错误。1234567895.

（2025·山东济宁检测）变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据DNA在不

同浓度的变性剂中解链程度的不同，导致电泳迁移率发生变化，从而将片

段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。当DNA片段泳动到某一浓度

的变性剂位置时，DNA发生解旋变性，导致电泳迁移率下降，最终会停留

在某一位置。下列说法正确的是（

）A.

提高电泳的温度有利于提高分离效率B.DGGE技术可用于基因突变检测及相关研究C.DNA中的A、T碱基含量越高越不容易发生变性D.

电泳时需将待测DNA与电泳缓冲液混合后注入加样孔内√123456789解析：电泳温度过高易使DNA发生解旋变性，导致电泳迁移率下降，不利于提高分离效率，A错误；DNA中A和T之间有两个氢键，G和C之间有三个氢键，故DNA中的A与T碱基含量越高越容易发生变性，C错误；电泳时需将待测DNA与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，D错误。1234567896.

（2025·贵州遵义期末）将酵母菌的质粒连接上干扰素基因后再导入酵

母菌细胞中，进行目的基因的检测和鉴定获得能产干扰素的基因工程菌。

下图所示为有关DNA片段的扩增及电泳鉴定结果，①②③代表不同加样

孔，下列叙述正确的是（

）A.

为了获得更多DNA，PCR反应体

系的成分用量可增加B