生物制品亚硫酸盐测定指南（试行）

生物制品亚硫酸盐测定指南（试行）1范围

本指南适用于疫苗类、抗毒素及抗血清类、血液制品类、重组蛋白/多肽类、细胞治疗相关制剂类等生物制品的原液、中间品、成品中亚硫酸盐（以二氧化硫计，下同）的定性及定量测定，涵盖游离型亚硫酸盐、结合型亚硫酸盐的总含量测定，不同基质样品的检测方法选择可参考本指南对应章节要求。本指南不适用于含高浓度还原性巯基基团的生物制品亚硫酸盐测定，此类样品需预先去除巯基干扰后再行检测。

2规范性引用文件

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《中华人民共和国药典》2025年版三部生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB5009.34-2022食品安全国家标准食品中亚硫酸盐的测定

ISO10304-1:2007水质离子色谱法测定溶解性阴离子第1部分：溴化物、氯化物、氟化物、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐的测定

YY/T0885-2013医用食品营养素及添加物的测定

3术语和定义

3.1总亚硫酸盐：指样品中游离型亚硫酸盐与结合型亚硫酸盐的总和，测定结果统一以二氧化硫（SO₂，CAS号：7446-09-5）的质量浓度或质量分数表示。

3.2游离型亚硫酸盐：指以亚硫酸根（SO₃²⁻）、亚硫酸氢根（HSO₃⁻）、焦亚硫酸根（S₂O₅²⁻）形式存在的可直接参与氧化还原反应的亚硫酸盐形态。

3.3结合型亚硫酸盐：指与生物制品基质中的醛基、酮基、蛋白氨基、多糖羟基等共价结合的亚硫酸盐，通常需经酸化、加热、解吸附等前处理步骤释放后才可被测定。

3.4方法检出限：指在95%置信水平下，特定检测方法可定性区分于空白背景的亚硫酸盐最低浓度。

3.5方法定量限：指特定检测方法可对亚硫酸盐进行准确定量的最低浓度，定量结果的相对标准偏差需≤10%、回收率需在80%~110%范围内。

4检测方法原理及适用范围

4.1盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理：亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的二氯亚硫酸汞钠络合物，该络合物可与甲醛反应生成羟甲基磺酸，再与盐酸副玫瑰苯胺发生亲核加成反应生成紫红色络合物，络合物的吸光度与亚硫酸盐含量在一定范围内呈线性相关，可于550nm波长处比色定量。

适用范围：适用于基质复杂度较低、亚硫酸盐含量在0.3mg/L~10mg/L范围的非吸附类生物制品测定，如无佐剂重组蛋白疫苗、血液制品中间品等；不适用于含维生素C浓度≥10mg/L、含还原性多糖浓度≥50mg/L的样品，此类基质会导致测定结果偏低。

4.2离子色谱法

原理：分为直接测定法与曝气-吸收测定法两类。直接测定法：样品经甲醛稳定、除蛋白、除杂质处理后，亚硫酸根在阴离子交换色谱柱中与其他阴离子实现分离，经电导检测器定量，直接换算为亚硫酸盐含量。曝气-吸收测定法：样品经磷酸酸化后加热至60℃，结合态亚硫酸盐分解释放为二氧化硫，经99.99%纯度氮气吹扫导入0.3%过氧化氢吸收液中，二氧化硫被过氧化氢氧化为硫酸根，经离子色谱分离定量后，通过摩尔质量换算得到总亚硫酸盐含量。

适用范围：本方法为仲裁方法，适用于所有类型生物制品的亚硫酸盐测定，尤其适用于含佐剂制品、高浓度蛋白制品、含干扰物质制品等复杂基质样品，测定范围为0.15mg/L~100mg/L。

4.3碘量滴定法

原理：样品经磷酸酸化后，亚硫酸盐被过量碘标准溶液氧化为硫酸盐，剩余的碘以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，根据空白与样品消耗硫代硫酸钠的体积差计算亚硫酸盐含量。

适用范围：适用于亚硫酸盐含量≥10mg/L的生产过程中间品、原液等样品测定，操作简便、检测周期短，但灵敏度较低，不适用于低含量成品的痕量测定。

5试剂与材料

5.1通用要求

所有试剂除另有规定外均为优级纯，实验用水符合GB/T6682-2008的一级水要求，所有试剂开封后需标注开封日期、有效期，亚硫酸盐相关标准溶液需临用现配。所有玻璃器具均需经10%硝酸浸泡24h后，用一级水冲洗3次晾干后使用，避免残留还原性物质干扰测定。

5.2通用试剂

氮气（纯度≥99.99%）、磷酸（优级纯）、氢氧化钠（优级纯）、浓硫酸（优级纯）、钨酸钠（分析纯）、柠檬酸（优级纯）、甲醛溶液（优级纯，无聚合沉淀）。

5.3方法专用试剂

5.3.1盐酸副玫瑰苯胺比色法专用试剂

四氯汞钠吸收液：称取13.6g氯化汞、5.8g氯化钠溶于1000mL水中，搅拌至完全溶解，放置12h后用定性滤纸过滤，4℃避光保存，有效期3个月。

2g/L甲醛溶液：移取0.5mL含量为36%~38%的甲醛溶液，加水稀释至100mL，临用现配。

盐酸副玫瑰苯胺溶液：称取0.1g提纯后的盐酸副玫瑰苯胺，加入20mL1mol/L盐酸溶液溶解，加水定容至100mL，4℃避光保存，有效期1个月。

亚硫酸盐标准储备液：称取0.1g亚硫酸钠（Na₂SO₃）溶于200mL四氯汞钠吸收液中，放置2h后用碘量法标定其浓度，4℃避光保存有效期7d。

亚硫酸盐标准工作液：临用前将标定后的储备液用四氯汞钠吸收液稀释为含SO₂2μg/mL的工作液。

5.3.2离子色谱法专用试剂

0.3%过氧化氢吸收液：移取1mL30%优级纯过氧化氢溶液，加水稀释至1000mL，临用现配。

20mmol/L氢氧化钠淋洗液：称取0.8g优级纯氢氧化钠，溶于经脱气处理的1000mL一级水中，过0.22μm滤膜后超声脱气20min，密封保存有效期7d。

硫酸根标准储备液：1000mg/L有证标准物质，4℃避光保存有效期12个月。

硫酸根标准工作液：临用前将储备液用一级水稀释为0、0.5、1、5、10、20mg/L的系列标准溶液。

5.3.3碘量法专用试剂

0.01mol/L碘标准溶液：购买有证标准物质或按GB/T601要求配制标定，4℃避光保存有效期3个月。

0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液：购买有证标准物质或按GB/T601要求配制标定，4℃避光保存有效期1个月。

10g/L淀粉指示剂：称取1g可溶性淀粉，加入少量水调成糊状，倒入100mL沸水中煮沸至透明，冷却后加入0.1g水杨酸防腐，4℃保存有效期1个月。

1+1磷酸溶液：移取50mL优级纯磷酸，缓慢加入50mL水中，冷却后备用。

5.4仪器设备

紫外可见分光光度计（波长范围190nm1100nm，吸光度精度±0.001Abs）、离子色谱仪（带电导检测器、阴离子抑制器）、电子分析天平（分度值0.1mg、0.01mg各1台）、高速冷冻离心机（最大转速≥15000r/min，控温范围4℃25℃）、恒温水浴箱（控温精度±0.5℃）、曝气装置（包含曝气瓶、吸收管、气体流量计、恒温水浴模块）、碘量瓶（250mL）、0.22μm水系微孔滤膜（聚醚砜材质）、移液器、容量瓶等。

6样品采集与前处理

6.1采样要求

每批待测试样需按照《中国药典》2025年版三部生物制品取样规程要求抽取至少3个独立包装单元，总取样量不少于20mL（或20g），需满足平行测定、方法学验证、留样的用量需求；冻干制剂需首先按照说明书要求加入规定体积的复溶液，涡旋振荡至完全复溶，无肉眼可见固体残留后再行取样。

6.2样品保存

亚硫酸盐具有易氧化、易分解特性，样品采集后需立即密封，4℃避光条件下储存，24h内完成测定；若无法及时测定，需按每10mL样品加入0.1mL0.1%甲醛稳定液的比例添加稳定剂，4℃避光储存最长不超过7d，所有样品需同步记录品名、批号、规格、生产企业、采样日期、复溶日期、基质类型等信息。

6.3前处理步骤

6.3.1无佐剂液体制剂/复溶后冻干制剂：准确移取1.0mL~5.0mL均一样品（根据预估亚硫酸盐含量调整取样量），置于25mL容量瓶中，加入0.5mL0.1%甲醛稳定液，加实验用水定容至刻度，摇匀后待测定；若样品预估浓度超过对应方法线性范围，可适当稀释后再行定容。

6.3.2铝佐剂吸附类制品：准确移取5.0mL均一样品，加入2mL0.5mol/L柠檬酸解吸液（pH=3.0），涡旋振荡5min，4℃条件下静置60min，12000r/min4℃离心10min，将全部上清转移至25mL容量瓶中，加入0.5mL0.1%甲醛稳定液，定容至刻度后待测定；需同步进行解吸附效率验证，解吸附效率应≥90%，否则需优化解吸液比例或静置时间。

6.3.3高浓度蛋白类制品（蛋白浓度≥100g/L，如白蛋白、免疫球蛋白等）：准确移取2.0mL样品，加入1mL100g/L钨酸钠溶液、1mL0.5mol/L硫酸溶液，涡旋振荡1min后4℃静置30min，15000r/min4℃离心15min，取全部上清转移至25mL容量瓶中，加0.5mL甲醛稳定液定容后待测定，若上清仍有浑浊，需重复离心或经0.45μm滤膜预过滤后再行定容。

6.3.4含高浓度干扰物质的样品：若样品中含维生素C、巯基化合物、还原性多糖等干扰物质，需采用曝气-吸收法前处理，无需进行除蛋白、解吸附等操作，直接取5.0mL样品加入曝气瓶中处理即可。

7测定步骤

7.1盐酸副玫瑰苯胺比色法

7.1.1标准曲线绘制：取6支25mL具塞比色管，分别加入0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mL浓度为2μg/mL的亚硫酸盐标准工作液，对应SO₂含量分别为0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μg，各管加入四氯汞钠吸收液补足至10mL，依次加入1mL2g/L甲醛溶液、1mL盐酸副玫瑰苯胺溶液，加盖摇匀后置于25℃恒温水浴箱中避光显色20min，用1cm比色皿，以空白管调零，于550nm波长处测定各管吸光度，以SO₂含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数r应≥0.999。

7.1.2样品测定：取10mL经前处理的待测液置于25mL比色管中，按上述标准曲线相同步骤操作，测定吸光度，代入回归方程计算待测液中SO₂含量，同步做空白试验。

7.2离子色谱法

7.2.1色谱条件：阴离子交换色谱柱（IonPacAS11-HC，4mm×250mm，或性能相当的色谱柱），保护柱为IonPacAG11-HC（4mm×50mm），淋洗液为20mmol/L氢氧化钠溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样体积25μL，电导检测器，抑制器为阴离子自动再生抑制器，抑制电流50mA。

7.2.2标准曲线绘制：将配制好的0、0.5、1、5、10、20mg/L硫酸根系列标准溶液按上述色谱条件进样测定，以硫酸根浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程相关系数r应≥0.9995。

7.2.3直接测定法操作：将经前处理的待测液过0.22μm聚醚砜滤膜，弃去前3mL滤液，取后续滤液进样测定，记录硫酸根峰面积，代入回归方程得到硫酸根浓度，换算为SO₂含量的系数为64.06/96.06（64.06为SO₂摩尔质量，96.06为硫酸根摩尔质量）。

7.2.4曝气-吸收法操作：组装曝气装置，将10mL0.3%过氧化氢吸收液加入吸收管中，将5.0mL待测液加入曝气瓶中，加入5mL1+1磷酸溶液，立即密封曝气瓶，将水浴温度升至60℃，通入氮气，调节气体流量为0.5L/min，连续曝气30min，将释放的SO₂全部吹入吸收液中，曝气完成后将吸收液转移至25mL容量瓶中定容，过0.22μm滤膜后进样测定，同步做空白试验。

7.3碘量法

准确移取50.0mL经前处理的待测液置于250mL碘量瓶中，加入25.00mL0.01mol/L碘标准溶液、5mL1+1盐酸溶液，立即密塞摇匀，暗处放置5min，用0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈浅黄色，加入1mL10g/L淀粉指示剂，继续滴定至蓝色完全消失且30s内不变色为终点，记录消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积V₁，同步做空白试验，记录空白消耗体积V₀。

8结果计算与表述

8.1计算公式

8.1.1盐酸副玫瑰苯胺比色法：X=(A-A0)×fV，其中X为样品中亚硫酸盐含量（mg/L，以SO₂计），A为待测液中SO₂质量（μg），A₀为空白试验中SO₂质量（μg），f为样品前处理稀释倍数，V为取样体积（mL）。

8.1.2离子色谱法：直接法X=c×64.0696.06×fV，曝气法X=c×25×64.0696.06×fV，其中c为测定得到的硫酸根浓度（mg/L），25为吸收液定容体积（mL），其余参数同上。

8.1.3碘量法：X=(V0-V1)×c×32.03×1000×fV，其中c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度（mol/L），32.03为1/2SO₂的摩尔质量（g/mol），其余参数同上。

8.2结果表述

测定结果<1mg/L时保留2位有效数字，1~10mg/L时保留1位小数，≥10mg/L时保留整数。

9方法学验证要求

9.1检出限与定量限：盐酸副玫瑰苯胺比色法检出限不得高于0.1mg/L、定量限不得高于0.3mg/L；离子色谱法检出限不得高于0.05mg/L、定量限不得高于0.15mg/L；碘量法检出限不得高于5mg/L、定量限不得高于10mg/L。

9.2精密度：取同一份阳性样品平行测定6次，测定结果的相对标准偏差（RSD）应≤10%；不同检测人员、不同实验室间测定结果的相对偏差应≤15%。

9.3准确度：分别在定量限、2倍定量限、10倍定量限三个浓度水平进行加标回收试验，每个水平平行测定3次，加标回收率应在80%~110%范围内。

9.4特异性：向空白样品中加入50倍定量限浓度的常见干扰物质（硫酸盐、亚硝酸盐、维生素C、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠、硫代硫酸钠），采用对应方法测定，测定结果与空白的偏差应≤10%，否则需更换抗干扰能力更强的检测方法（如离子色谱曝气法）。

10质量控制要求

10.1空白控制：每批样品测定需同步做2份空白试验，空白的响应值（吸光度或峰面积）不得超过标准曲线最低点响应值的10%，否则说明试剂或器具存在污染，需更换试剂或重新清洗器具后再测定。

10.2平行样控制：每批样品至少测定2份平行样，平行样测定结果的相对偏差应≤15%，否则需重新测定。

10.3质控样控制：每20份样品需同步测定1份有证亚硫酸盐标准物质或加标质控样，质控样的测定结果应在标称值的±20%范围内，否则整批样品测定结果无效，需重新处理测定。

10.4标准曲线控制：每批次测定需重新绘制标准曲线，不得使用历史标准曲线，若样品浓度超出线性范围，需稀释后重新测定，不得外推计算结果。

11注意事项

11.1试剂管理：四氯汞钠为剧毒试剂，操作时需佩戴丁腈手套、护目镜，在通风橱内操作，含汞废液需单独收集于专用重金属废液容器中，标注“含汞废液”，交由有资质的危废处理单位处置，严禁直接排放。盐酸副玫瑰苯胺的纯度直接影响空白值，若空白吸光度≥0.05Abs，需对试剂进行提纯。亚硫酸钠标准溶液稳定性差，储备液需每7d重新标定1次，标准工作液需临用现配。

11.2样品处理：所有样品前处理操作需在避光、低温条件下进行，避免亚硫酸盐被氧化；含结合型亚硫酸盐含量较高的样品（如加有蔗糖、麦芽糖的冻干制剂）需采用曝气-吸收法前处理，酸化加热温度控制在60℃±2℃，确保结合态亚硫酸盐完全释放。铝佐剂吸附类样品需验证解吸附效率，若解吸附