生物制品真菌检查指南（试行）

生物制品真菌检查指南（试行）本指南适用于我国境内上市的预防类、治疗类、诊断类生物制品全生命周期各环节的真菌检查工作，覆盖范围包括：疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、基因工程疫苗等）、抗毒素及抗血清、血液制品、重组蛋白制品、基因治疗产品、细胞治疗产品、微生态制品的原液、半成品、成品的质量控制检验，以及生物制品生产用原辅材料、生产工艺用水、生产环境监测、清洁验证样本的真菌检测。本指南为试行技术规范，未尽事项需符合国家药品监督管理部门发布的相关法规、中国药典现行版要求。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则1107真菌计数法、通则1108无菌检查法、通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则《药品生产质量管理规范（2010年修订）》生物制品附录、无菌药品附录《病原微生物实验室生物安全管理条例》（2018年修订）ISO18593:2018食品和动物饲料微生物学酵母和霉菌计数的水平方法WHO生物制品质量控制指南（2023版）中国食品药品检定研究院《生物制品质量控制技术规范》（2022版）3.1真菌检查：指对生物制品各环节样本中真菌的定性检出、定量计数、菌种鉴定及安全性评估的总称，涵盖酵母、霉菌、产孢真菌及致病性真菌的检测。3.2酵母：单细胞真菌，形态多为卵圆形、圆形，菌落形态光滑、湿润、粘稠，多数通过芽生方式繁殖。3.3霉菌：多细胞真菌，具有菌丝和孢子结构，菌落形态多为绒毛状、絮状、棉絮状，可产生色素，通过孢子繁殖。3.4真菌检出限：指特定检验方法可稳定检出供试品中存在的最低真菌浓度，定性检查的检出限以cfu/单位样本量表示。3.5真菌回收率：指供试品中加入已知量的标准真菌菌株后，检验方法实际检出的菌落数与加标量的比值，以百分比表示。3.6过程空白：指检验全过程中采用与供试品处理同批次的无菌溶剂、耗材，按照与供试品完全相同的操作流程得到的对照样本，用于评估检验过程的污染情况。4.1检验人员需经过微生物检验基础理论、无菌操作技能、真菌鉴定技术、生物安全防护专项培训，经理论及实操考核合格后方可上岗，考核记录需存档至少3年。4.2检验人员每年需完成至少16学时的相关法规、技术更新、生物安全复训，定期参加真菌检验能力比对，比对结果需全部合格。4.3从事致病性真菌检验、菌种鉴定的人员，需具备2年以上微生物检验工作经验，掌握常见致病性真菌的形态学、生化、分子生物学鉴定技能，熟悉生物安全二级及以上实验室的操作规范。4.4检验人员进入洁净检验区域需严格执行更衣流程，不得佩戴首饰、化妆，洁净服需定期更换灭菌，手部消毒采用75%乙醇或0.1%苯扎溴铵溶液，每2小时复消一次。4.5检验人员若出现呼吸道感染、皮肤破损等情况，不得进入无菌检验区域，避免造成样本污染或职业暴露。5.1检验区域分级要求5.1.1最终灭菌生物制品、非最终灭菌无菌生物制品的成品、原液、半成品真菌检查，需在B级背景下的A级单向流区域内操作；生产环境监测、清洁验证、原辅材料样本的检验，可在C级背景下的A级单向流区域内操作。5.1.2真菌检验区域需与细菌检验、病毒检验区域物理隔离，避免交叉污染，检验区域内不得存放与检验无关的物品，人流、物流需分开，不得逆向流动。5.2环境监测要求5.2.1真菌检验区域的洁净度指标需符合以下要求：A级区沉降菌（φ90mm平皿，暴露4h）≤0cfu/皿，浮游菌≤0cfu/m³，表面真菌≤0cfu/25cm²；B级区沉降菌≤10cfu/皿，浮游菌≤10cfu/m³，表面真菌≤5cfu/25cm²；C级区沉降菌≤50cfu/皿，浮游菌≤100cfu/m³，表面真菌≤25cfu/25cm²；D级区沉降菌≤100cfu/皿，浮游菌≤200cfu/m³，表面真菌≤50cfu/25cm²。5.2.2洁净区需每周开展一次真菌专项监测，包括沉降菌、浮游菌、表面微生物（台面、设备表面、人员手套），监测数据需存档至少5年，若出现连续3次监测超标，需暂停检验工作，排查污染源，整改合格后方可恢复工作。5.3专用设施要求5.3.1需配备专用真菌培养箱，不得与细菌、病毒培养共用，培养箱温度控制精度为±1℃，湿度控制范围为45%-60%，避免湿度过高导致真菌孢子扩散。5.3.2需配备II级A2型及以上生物安全柜，处理致病性真菌样本需采用II级B2型生物安全柜，生物安全柜需放置在B级洁净区内，每年开展一次性能验证，包括高效过滤器完整性、气流速度、气流模式、负压等指标，验证合格后方可使用。5.3.3需配备专用高压灭菌器，用于真菌检验废弃物的灭菌处理，灭菌参数为121℃、30min，每批次灭菌需采用嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂进行灭菌效果验证，灭菌合格率需达到100%。5.3.4检验区域需配备独立的排风系统，排风需经过高效过滤器过滤后排放，避免真菌孢子排放到外界环境中。6.1设备管理要求6.1.1检验用设备需按照计量法规要求定期校准，其中移液器校准周期为3个月，误差允许范围为±2%；天平校准周期为1年，精度需达到0.01g；菌落计数器校准周期为1年，计数误差≤±5%；PCR仪、MALDI-TOF质谱仪等鉴定设备校准周期为1年，扩增效率、分辨率等指标需符合检验要求。6.1.2真菌培养箱需每天至少记录2次温度，温度偏差不得超过设定值±2℃，每季度开展一次温度分布验证，箱内各点位温度差不得超过±1℃，验证合格后方可继续使用。6.1.3薄膜过滤器的蠕动泵转速需经过验证，过滤过程中不得产生气泡、不得损伤滤膜，滤膜夹持器需每次使用后灭菌，避免交叉污染。6.2耗材管理要求6.2.1检验用培养基优先选用中国药典收录的配方，商品化培养基需取得国家药品监督管理部门的医疗器械注册证，每批次培养基需开展适用性检查，包括无菌性检查、促生长能力检查、抑制能力检查。6.2.2培养基适用性检查要求：无菌性检查需将培养基置于22-25℃培养7天，不得有任何微生物生长；促生长能力检查采用标准菌株白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003，接种量为10-100cfu，培养5天后计数，回收率需达到70%-130%；抑制能力检查是在培养基中加入规定量的抑制剂（如氯霉素、孟加拉红），接种100cfu的大肠杆菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，培养48h后不得有细菌生长，避免细菌干扰真菌计数。6.2.3滤膜选用0.45μm孔径的混合纤维素酯膜或聚醚砜膜，使用前需检查滤膜完整性，不得有破损，滤膜需经过无菌验证，无真菌残留。6.2.4一次性耗材（平皿、吸头、采样管）需为无菌无热源产品，使用前检查包装完整性，若包装破损、超过有效期不得使用；复用耗材需经过180℃干热灭菌2h或121℃高压灭菌30min，灭菌后有效期为7天，超过有效期需重新灭菌。6.2.5中和剂需经过验证，对真菌生长无抑制作用，常用中和剂包括：针对含硫柳汞的样品采用0.1%硫代硫酸钠溶液，针对含β-内酰胺类抗生素的样品采用β-内酰胺酶，针对含季铵盐类消毒剂的样品采用0.3%卵磷脂溶液，针对含酚类消毒剂的样品采用0.5%吐温80溶液。7.1样本采集与流转7.1.1样本采集需严格执行无菌操作，避免环境、人员污染，采样工具需经过灭菌处理，采样人员需穿戴无菌手套、口罩、洁净服。7.1.2采样量要求：成品检验需至少抽取10个独立最小包装，总样本量不少于20ml（g）；原液、半成品检验样本量不少于10ml（g）；原辅材料检验样本量不少于50ml（g）；生产环境沉降菌监测采用φ90mm平皿暴露4h，浮游菌监测采样量不少于1m³；表面微生物监测采用无菌棉签擦拭10cm×10cm的表面区域，擦拭后放入装有10ml无菌生理盐水的采样管中。7.1.3样本采集后需标注唯一标识，包括样品名称、批号、采样日期、采样点、采样人，样本需在2h内送检，若无法及时送检，需置于2-8℃条件下保存，保存时间不得超过24h，不得冷冻保存，避免真菌死亡。7.2样本前处理7.2.1普通液体制剂：直接取规定量样本进行检验，若样本含抑菌成分，需先加入经过验证的中和剂，涡旋混匀后室温放置10min，中和抑菌成分。7.2.2特殊样品处理：①细胞治疗类产品：取供试品加入终浓度0.1%的无菌TritonX-100溶液，室温放置5min裂解细胞后，再进行过滤操作，裂解液需经过验证无真菌毒性，对白色念珠菌、黑曲霉的回收率≥70%；②含铝佐剂的疫苗产品：加入pH3.0的0.1mol/L无菌柠檬酸缓冲液，涡旋混匀至佐剂完全溶解后，再进行检验；③冻干制剂：按说明书要求加入规定体积的灭菌注射用水，完全复溶后进行检验；④油性制剂：加入终浓度0.5%的无菌吐温80，37℃水浴10min充分乳化后再进行稀释或过滤；⑤固体原辅材料：取20g样品加入180ml无菌生理盐水，均质1min（转速10000rpm），制成1:10稀释液后进行检验。7.3定性检查（真菌限度检查）7.3.1检验方法优先采用薄膜过滤法：取规定量样本，通过0.45μm滤膜过滤，采用100ml无菌生理盐水分3次冲洗滤膜，每次冲洗量不少于30ml，冲洗过程中轻轻摇动过滤器，避免样本残留。过滤完成后，用无菌镊子取出滤膜，菌面朝上贴在沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基表面，排除滤膜与培养基之间的气泡，每个样本做2份平行样。7.3.2对照设置：每份检验需设置过程空白对照、阳性对照。过程空白对照采用与样本同批次的无菌生理盐水，按照与样本完全相同的操作流程处理，用于评估检验过程的污染情况；阳性对照在过滤完成后，在滤膜上接种10-100cfu的白色念珠菌和黑曲霉混合菌悬液，同法培养，用于验证检验方法的有效性。7.3.3培养条件：将接种后的平皿倒置，置于22-25℃培养箱中培养7天，若需检测致病性真菌，需同步设置35±2℃培养箱平行培养5天，观察菌落生长情况。7.3.4结果判定：若过程空白对照无真菌生长，阳性对照有典型真菌菌落生长，样本平皿无真菌菌落生长，判定为定性检查合格；若样本平皿有真菌菌落生长，需首先排除检验过程污染，取双倍样本量进行复试，复试更换检验人员、更换批次培养基，若复试仍检出真菌，判定为定性检查不合格。7.4定量检查（真菌计数）7.4.1检验方法选择：真菌含量较高的原辅材料、环境样本采用平皿倾注法或涂布法，真菌含量较低的生物制品原液、半成品、成品采用薄膜过滤法。7.4.2平皿倾注法：取1ml适当稀释度的样本液加入无菌平皿，注入融化后冷却至45℃的SDA培养基15-20ml，轻轻摇匀，待培养基凝固后倒置培养，每个稀释度做2份平行样，至少设置3个连续10倍稀释度，确保有1-2个稀释度的菌落数在10-150cfu/皿范围内。7.4.3涂布法：取0.1ml适当稀释度的样本液，均匀涂布在预先凝固的SDA培养基表面，置于超净台内晾干5min后倒置培养，每个稀释度做2份平行样。7.4.4薄膜过滤法操作同7.3.1，培养后计数滤膜上的真菌菌落数。7.4.5培养条件：22-25℃培养5天，第3天开始观察菌落生长情况，若发现有霉菌菌落蔓延，可提前计数，或在培养基中添加0.1%孟加拉红抑制菌落蔓延。7.4.6计数规则：选取菌落数在10-150cfu之间的平皿计数，分别计数酵母和霉菌的菌落数，计算2份平行样的平均值，结果以cfu/ml（g、皿）表示。若所有稀释度的菌落数均小于10cfu，报告为<10cfu/ml（g）；若所有稀释度的菌落数均大于150cfu，取最高稀释度的菌落数乘以稀释倍数报告结果。7.4.7回收率验证：每批次定量检验需做加标回收试验，加标量为10-100cfu，回收率需≥70%，否则试验无效，需重新检验。8.1鉴定范围：所有检出的真菌菌株均需开展菌种鉴定，明确到种水平，若检出致病性真菌，需同步开展毒力评估。8.2形态学鉴定：挑取单个菌落，涂片后进行革兰染色（酵母）或乳酸酚棉蓝染色（霉菌），显微镜下观察形态特征：酵母为革兰阳性卵圆形细胞，可见芽生孢子；霉菌观察菌丝形态（有隔/无隔）、孢子形态（分生孢子、孢子囊孢子）、菌落颜色、质地等，对照真菌图谱进行初步鉴定。8.3生化鉴定：采用商品化真菌生化鉴定试剂盒（如API20CAUX、VITEK2YST卡）进行生化反应检测，按照说明书要求操作，鉴定可信度≥90%的可确定到属水平。8.4分子生物学鉴定：形态学、生化鉴定无法确定的菌株，采用ITS（内转录间隔区）测序鉴定，扩增ITS1-5.8S-ITS2区域，PCR产物纯化后测序，序列与NCBI、UNITE数据库进行比对，同源性≥99%的可确定到种水平。8.5质谱鉴定：采用MALDI-TOF质谱仪进行鉴定，样品制备按照说明书要求操作，鉴定得分≥2.0的可确定到种水平，得分在1.7-2.0之间的可确定到属水平。8.6菌株保藏：所有分离的真菌菌株需按照唯一编号保藏，记录菌株来源、分离时间、鉴定结果，采用甘油管保藏法置于-80℃冰箱保藏，保藏时间不少于产品有效期后1年，且不少于2年，保藏的菌株需定期复苏验证活性。9.1检验报告内容需包括：样品名称、批号、规格、生产企业、采样日期、检验日期、检验依据、检验项目、检验方法、培养条件、检出真菌种类、数量、检验结论、检验人、复核人、批准人、报告日期，检验报告需加盖检验机构公章，具有可追溯性。9.2报告时限：定性检查报告需在7个工作日内出具，定量检查报告需在7个工作日内出具，需开展菌种鉴定的，报告需在15个工作日内出具。9.3偏差处理：若检出真菌不合格，需立即启动偏差调查程序，首先排查检验过程污染：核查过程空白对照、环境监测数据、人员操作记录、耗材灭菌记录，排除实验室污染后，启动生产过程溯源：核查原辅材料检验报告、生产环境监测数据、工艺用水监测数据、生产设备清洁消毒记录、人员卫生记录、生产工艺参数记录，明确污染来源，形成偏差调查报告。9.4纠正预防措施：根据溯源结果，采取针对性的纠正预防措施，包括更换不合格原辅材料、对生产环境进行熏蒸消毒、优化清洁消毒程序、开展人员专项培训、完善生产工艺无菌保障参数等，纠正预防措施需经过有效性验证，避免同类问题重复发生。10.1内部质量控制：每批次检验需设置过程空白对照、阳性对照、加标回收试验，过程空白对照不得有真菌生长，阳性对照回收率需达到70%-130%，环境监测结果符合要求，否则检验结果无效。10.2外部质量评估：检验机构每年至少参加2次国家级或省级药品检验机构组织的真菌检验能力验证，能力验证结果需为满意，若出现不满意结果，需暂停相关检验工作，开展整改，整改合格后方可恢复工作。10.3方法验证：采用中国药典未收录的检验方法时，需开展完整的方法学验证，验证指标包括专属性、检出限、定量限、回收率、精密度、耐用性：专属性需验证方法不受样品基质、共存微生物的干扰；定性检出限需≤10cfu/100ml样品；定量限需≤10cfu/ml；回收率需≥70%；精密度的相对标准偏差≤20%；耐用性需验证微小的参数变动（如培养温度±2℃、培养时间±1天）对检验结果无显著