肝脏干细胞产品质量控制指南（试行）

肝脏干细胞产品质量控制指南（试行）1适用范围本指南适用于开展临床研究及临床试验的人源肝脏干细胞产品，包括成体肝脏组织来源原代肝脏干细胞/祖细胞、成体多能干细胞（包括间充质干细胞、诱导多能干细胞（iPSC）、人胚胎干细胞（hESC））诱导分化来源的肝脏干细胞/祖细胞产品，可为注册申报阶段的质量控制提供参考。2原材料质量控制2.1供体来源质量控制2.1.1供体基本要求所有供体必须签署知情同意书，符合伦理审查要求。自体供体需排除活动性感染、恶性肿瘤、遗传性肝病；异体供体需增加排除标准：供体无家族遗传性疾病史、无10年内恶性肿瘤病史、无慢性传染性疾病史。不同来源供体额外要求：（1）成体肝组织供体：年龄范围18-65周岁，排除病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化、肝脏占位性病变、自身免疫性肝病，供体血清学及病原学筛查全部阴性；（2）脐带/胎盘来源供体：要求产妇年龄20-35周岁，妊娠37-42周足月妊娠，无妊娠高血压、妊娠期糖尿病、宫内感染等妊娠并发症，产前乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）1/2型、梅毒螺旋体（TP）、巨细胞病毒（CMV）、风疹病毒（RV）、弓形虫（TOX）、单纯疱疹病毒（HSV）筛查全部阴性，新生儿出生后1分钟Apgar评分≥8分，无先天畸形；（3）iPSC供体：供体体细胞来源筛查同成体供体，诱导过程无致瘤性病毒载体基因整合，建系后经全基因组测序无致病性点突变及大片段结构变异。2.1.2供体病原学强制筛查项目所有供体必须完成以下筛查，结果阴性方可使用：HBsAg、抗HCV抗体、抗HIV1/2抗体、抗TP抗体、CMV-DNA、EB病毒（EBV）-DNA、人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）1/2抗体，筛查时间距原材料采集不超过3个月，超出时限需重新筛查。2.2细胞库质量控制肝脏干细胞产品必须建立三级细胞库体系，即原始细胞库（OCB）、主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB），各级细胞库需按照以下项目完成检定，合格后方可投入生产：（1）一般检查：细胞形态符合肝脏干细胞特征，细胞活率≥90%，细胞计数符合建库要求；（2）细胞鉴别：STR基因型鉴定与原始供体匹配度≥90%，无交叉污染；肝系标志物EpCAM阳性率≥80%、CK19阳性率≥70%，符合目标细胞特征；（3）纯度：非目标细胞CD45阳性率≤2%、CD31阳性率≤2%，符合要求；（4）安全性：无菌、支原体、内毒素、外源病毒筛查全部阴性，染色体核型分析异常率≤5%；（5）稳定性：复苏后传代3代，细胞活力、标志物表达变异率≤10%，无不可控变异。3生产过程质量控制3.1生产环境与人员控制肝脏干细胞生产必须符合药品生产质量管理规范（GMP）要求，细胞分离、诱导、灌装核心操作区为万级洁净区背景下局部A级洁净度，更衣缓冲区为万级，辅助区为十万级。环境监测项目：悬浮粒子、沉降菌、浮游菌，每两周监测一次，结果符合GMP洁净度等级要求。生产操作人员必须经岗位培训合格，每年进行一次健康体检，排除传染性疾病，患有活动性感染、传染性疾病者不得进入生产区。3.2原辅料入厂检验生产用所有原辅料必须进行入厂检验，合格方可使用：重组细胞因子纯度≥98%，内毒素含量≤0.1EU/μg，支原体阴性；胶原酶活性≥125CDU/mg，内毒素≤0.5EU/mg；冻存液用二甲亚砜（DMSO）纯度≥99.9%，内毒素≤0.1EU/mL；胎牛血清若使用，需符合《中华人民共和国药典》要求，HBV、HCV、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等外源因子阴性。3.3关键工序过程控制（1）原代分离工序：组织采集后2小时内进入处理流程，消化温度控制在37℃±1℃，消化结束后取样检测细胞活率，活率≥85%方可进入纯化工序；（2）诱导分化工序：诱导分化过程分阶段设置质量控制点，诱导第7天检测甲胎蛋白（AFP）表达，要求AFP阳性率≥40%；诱导第14天（终末诱导结束）检测白蛋白、CK18表达，要求白蛋白阳性率≥70%，诱导过程中每3天更换一次培养基，培养温度控制在37℃±0.5℃，二氧化碳浓度5%±0.5%，每诱导批次取样检测无菌、支原体，合格方可进入扩增工序；（3）扩增工序：细胞扩增代次不得超过预设阈值，一般肝脏干细胞扩增代次不得超过15代，每代扩增结束取样检测细胞活率，活率≥85%方可进入下一扩增代次，扩增过程中不得添加抗生素，仅原代分离阶段可短期使用抗生素，终产品不得检出抗生素残留；（4）灌装冻存工序：灌装前复核细胞浓度、活率，灌装过程控制温度在2-8℃，每袋/每支产品灌装量误差控制在标示量的±5%以内，冻存程序采用梯度降温，降温速率控制在1℃/分钟从室温降到-80℃，24小时内转入气相液氮储存。4终产品质量控制终产品放行前必须完成以下所有项目检测，全部合格方可放行：4.1一般属性检测（1）细胞形态：镜下观察细胞呈卵圆形或短梭形，核质比适中，符合肝脏干细胞形态特征，无异常形态细胞；（2）细胞活率：采用台盼蓝染色法或流式细胞术检测，活细胞率≥90%；（3）细胞浓度：细胞浓度符合标示要求，误差范围为标示量的±10%；（4）pH值：要求为7.2-7.4；（5）渗透压：要求为280-320mOsm/kg·H2O。4.2细胞鉴别检测（1）免疫表型检测：采用流式细胞术检测细胞表面及胞内标志物，要求EpCAM阳性率≥80%，白蛋白阳性率≥70%，CK19阳性率≥70%，CD45阳性率≤2%，CD31阳性率≤2%；iPSC/hESC来源肝脏干细胞需额外检测未分化细胞残留，Oct4阳性残留率≤0.1%，SSEA4阳性残留率≤0.1%，排除未分化干细胞致瘤风险；（2）基因型鉴定：采用STR分型检测，基因型与原始供体基因型匹配度≥90%，排除细胞交叉污染；（3）特异性功能初步鉴定：采用靛青绿（ICG）摄取实验，ICG阳性细胞率≥70%，证明细胞具备肝脏特异性摄取功能。4.3纯度与均一性检测（1）杂质残留检测：①胎牛血清残留：若生产过程使用胎牛血清，终产品牛血清白蛋白残留量≤50ng/mL；②DMSO残留：终产品DMSO残留量≤10%（v/v），无血清冻存产品DMSO残留量≤5%（v/v）；③抗生素残留：终产品不得检出任何生产过程添加的抗生素；④血红蛋白残留：红细胞残留≤0.5%，血红蛋白残留符合《中华人民共和国药典》要求；（2）均一性检测：同一批次细胞大小变异系数≤20%，不同取样点标志物阳性率变异系数≤10%，不同批次终产品白蛋白合成量变异系数≤15%。4.4安全性检测（1）无菌检查：按照《中华人民共和国药典》三部通则1101进行需氧菌、厌氧菌、真菌、分枝杆菌检查，结果为无菌生长；（2）支原体检查：按照《中华人民共和国药典》三部通则1104，采用培养法或荧光染色法检测，结果为阴性；（3）内毒素检查：按照《中华人民共和国药典》三部通则1143，凝胶法检测，内毒素含量≤0.5EU/mL；（4）外源病毒因子检测：采用核酸扩增法检测HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA、EBV-DNA、HTLV-1/2-DNA，结果全部阴性；使用动物源原材料的产品需额外检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪细小病毒（PPV），结果阴性；（5）遗传稳定性检测：G显带法分析至少20个中期分裂相，染色体数目和结构异常率≤5%；采用拷贝数变异（CNV）测序，无致病性遗传变异，无肿瘤相关的大片段拷贝数变异；（6）致瘤性检测：异体来源、iPSC/hESC来源肝脏干细胞产品必须进行成瘤性检测，将至少1×10^7个细胞接种于免疫缺陷NOD/SCID小鼠背部皮下，观察12周，接种部位无肿瘤结节形成，组织病理学检查无异常增生，结果为阴性；自体来源产品需检测端粒酶活性，端粒酶活性≤10%阳性对照（HeLa细胞）活性，排除永生化转化细胞；（7）基因修饰肝脏干细胞额外检测：若为基因编辑修饰产品，需检测外源基因整合拷贝数，整合拷贝数符合设计要求，整合位点分析显示无原癌基因启动子区整合，插入突变风险符合安全要求，脱靶突变检测无致病性脱靶位点。4.5效力检测（1）白蛋白合成功能：将终产品细胞按1×10^6个接种，培养24小时后收集上清，ELISA法检测白蛋白含量，要求白蛋白合成量≥20μg/1×10^6细胞/24h；（2）尿素合成功能：同培养条件检测上清尿素含量，要求尿素合成量≥5μg/1×10^6细胞/24h，反映肝脏干细胞解毒功能；（3）糖原储存功能：采用过碘酸希夫（PAS）染色，PAS阳性细胞率≥80%，证明细胞具备肝脏特异性储能功能；（4）体内效力验证：新细胞株建库后的首三批产品需进行体内效力验证，在90%肝切除或D-氨基半乳糖诱导的肝衰竭小鼠模型中，输注1×10^6个肝脏干细胞后，小鼠2周生存率较阴性对照组提高≥40%，血清谷丙转氨酶、总胆红素水平较阴性对照组降低≥30%，证明产品具备预期生物学活性。5储存、运输与稳定性质量控制5.1储存质量控制各级细胞库及终产品必须储存于气相液氮罐中，储存温度≤-150℃，温度监测系统连续记录温度，每2小时自动记录一次，温度偏差超出范围（±10℃）超过1小时，需启动偏差调查，评估产品质量，不合格产品不得放行。冻存产品有效期设定为2年，有效期内每半年抽样检测一次细胞活率，细胞活率下降不超过10%、无菌检测阴性方可继续储存。5.2运输质量控制终产品运输采用干冰保温运输，全程温度控制在≤-130℃，运输箱内置可追溯温度记录仪，全程连续记录温度，到达接收单位后，若温度>-130℃持续时间超过1小时，判定产品不合格，不得使用。复苏后产品室温（15-25℃）放置不得超过6小时，2-8℃放置不得超过24小时，超时不得用于临床。5.3稳定性研究要求生产企业必须完成三批次产品的稳定性研究：①实时稳定性研究：冻存产品每3个月取样检测一次，连续检测2年，检测项目包括细胞活率、免疫表型、无菌、白蛋白合成能力，细胞活率下降不超过10%，其他指标符合标准，证明稳定性合格；②复苏后稳定性研究：复苏后分别在0h、2h、4h、6h、12h、24h取样检测，确定复苏后的最长放置时间，制定产品使用时限；③加速稳定性研究：将产品置于-80℃储存，每月取样一次，连续检测6个月，评估产品稳定性，验证有效期设定的合理性。6放行、追溯与文档管理6.1产品放行要求每一批次产品必须所有质量控制项目全部合格，由质量授权人签字后方可放行，放行需附带完整的批记录，包括供体筛查报告、细胞库检定报告、批生产记录、批检验报告、伦理审查文件复印件，缺一不可放行。6.2不合格品与偏差管理任何一项质量指标不合格的产品，必须标记为不合格，隔离存放，按照生物医疗废弃物管理规范进行高压灭菌处理，记录不合格原因、处理过程并存档。生产过程中出现的任何偏差（如温度偏差、洁净度超标），必须开展偏差调查，评估