脐带干细胞产品质量控制指南（试行）

脐带干细胞产品质量控制指南（试行）本指南为脐带干细胞产品质量控制试行规范，适用于从健康捐赠者脐带/脐带血组织中分离、制备、冻存、复苏及临床级应用的所有脐带干细胞产品，包括脐带来源间充质干细胞（UC-MSC）、脐带血来源造血干细胞（UCB-HSC）、工程化修饰脐带干细胞衍生产品，供细胞制备机构、第三方质检机构、临床使用单位及监管部门参考执行。一、规范性引用文件本指南编制参考以下现行有效规范，如遇规范更新以最新版本为准：1.国家药品监督管理局《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》（2017年）2.国家药品监督管理局《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2021年）3.《中华人民共和国药典》（2020年版）三部生物制品质量控制相关要求4.国家卫生健康委员会《体细胞治疗临床研究和转化应用管理办法（试行）》（2019年）5.《医药工业洁净厂房设计标准》GB50457-20196.国际细胞治疗学会（ISCT）间充质干细胞鉴定标准（2006年）7.ISO20399:2018《生物技术细胞治疗产品生产用辅料质量要求》二、质量控制基本要求2.1人员要求所有从事脐带干细胞质检的人员需具备生物学、医学等相关专业本科及以上学历，拥有2年以上细胞生物检定相关工作经验，上岗前需通过生物安全防护、无菌操作、检验方法学操作三类专项培训并考核合格，年度再培训时长不少于40学时，离岗6个月及以上返回岗位需重新开展全项考核，考核合格后方可独立开展质检工作。2.2环境要求脐带干细胞制备、取样及核心质检操作需在B+A级洁净环境内开展，洁净区静态环境参数需符合以下要求：悬浮粒子≥0.5μm最大允许数为3520个/m³、≥5μm最大允许数为20个/m³；动态浮游菌≤1cfu/m³，沉降菌≤1cfu/Φ90mm皿（暴露4h），表面微生物≤1cfu/皿（接触法）。洁净区环境监测频次为：温湿度、压差每日监测2次，悬浮粒子、浮游菌每月监测1次，高效过滤器检漏每6个月开展1次，所有环境监测记录留存至少5年。2.3设备要求所有质检用设备需建立唯一台账，定期开展计量校准与性能验证：流式细胞仪、荧光定量PCR仪校准周期不超过6个月，细胞计数仪、酶标仪、渗透压仪校准周期不超过3个月，生物安全柜、液氮罐、冷链运输箱性能验证周期不超过12个月，所有校准、验证证书需留存至设备报废后5年。2.4物料要求所有用于脐带干细胞制备、质检的试剂、耗材需优先选用无动物源成分、无血清、无饲养层的医疗级产品，且获得国家相关医疗器械/药品注册证，同一批次产品的物料供应商不得随意变更，如需变更需完成3批连续制备产品的一致性验证，验证合格后方可启用新供应商物料。三、供体筛查阶段质量控制3.1供体入选标准捐赠者为18-35周岁健康育龄女性，单胎足月妊娠，孕周37-42周，产前检查无妊娠高血压、妊娠糖尿病、前置胎盘等妊娠合并症，夫妻双方无乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒等传染性疾病史，无遗传性疾病家族史，无肿瘤病史、免疫性疾病史，近1年无输血史、器官移植史，近3个月无疫区旅居史、未接受活病毒疫苗接种。供体需签署知情同意书，明确同意脐带组织用于干细胞制备及研究、临床应用。3.2筛查检测项目需分别采集分娩前72h内母体外周血5mL、分娩时脐带血10mL开展双样本检测，检测项目包括：1.传染性指标：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗体（抗-HCV）、人类免疫缺陷病毒1/2型抗体（抗-HIV1/2）、梅毒螺旋体抗体（抗-TP）、巨细胞病毒（CMV）IgM/IgG、EB病毒（EBV）IgM、人类T淋巴细胞病毒（HTLV）I/II型抗体、寨卡病毒抗体、弓形虫抗体，其中HBV、HCV、HIV、TP需同步开展高敏核酸检测（NAT），最低检测限≤50IU/mL，所有传染性指标阴性方可纳入供体库，如CMVIgG阳性需额外开展外周血CMV核酸检测，结果阴性方可入组。2.遗传指标：外周血染色体核型G显带分析，计数30个分裂相，核型为正常二倍体，无染色体数目异常、结构畸变；针对脆性X综合征、α/β地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、脊髓性肌萎缩症等中国人群高发单基因遗传病开展位点检测，结果为阴性；对有遗传性疾病家族史的供体，需额外开展全外显子测序验证，排除致病突变携带。3.其他指标：母体外周血血常规、肝肾功能、甲状腺功能检测结果均在正常参考范围内。3.3资料留存供体知情同意书、产前检查完整报告、分娩记录、供体筛查检测报告、捐赠者联系方式需永久留存，至少满足产品全生命周期追溯要求，留存期限不得短于产品使用后30年。四、制备过程中间质量控制4.1组织接收质控脐带组织采集后需置于4-8℃无菌转运液中冷链运输，采集至实验室接收的时间间隔≤24h，运输过程温度偏差控制在±2℃以内，全程温度记录可追溯。实验室接收后先开展外观检测，脐带组织无破损、无溶血、无污染迹象，台盼蓝拒染法检测脐带组织活性≥90%，方可进入下一步处理。4.2分离培养质控脐带组织用无菌PBS冲洗3次，去除残留血液及脐带外膜，剪切成1-2mm³大小的组织块，采用胶原酶I消化法分离原代细胞，胶原酶I工作浓度为1mg/mL，37℃恒温消化30-60min，消化后过70μm细胞筛，离心收集细胞，原代细胞活率≥85%方可接种培养。原代培养72h后首次换液，去除未贴壁细胞，之后每48h换液1次，细胞汇合度达到80%-90%时开展传代，传代比例控制在1:2-1:3，累计传代次数不得超过P6代。培养过程每日开展倒置显微镜镜检，观察细胞形态，成纤维样梭形细胞占比≥95%，无杂细胞、无微生物污染迹象；每代次收集培养上清开展支原体荧光定量PCR检测，最低检测限≤10拷贝/反应，结果为阴性方可继续传代。4.3收获纯化质控细胞达到目标代次后，弃去培养上清，用无菌PBS冲洗3次，加入0.25%胰酶-EDTA消化2-3min，加入等体积无血清培养基终止消化，1200rpm离心5min收集细胞，采用密度梯度离心法或免疫磁珠法纯化细胞，纯化后活细胞率≥90%，杂细胞占比≤1%方可进入下一步制剂或冻存环节。4.4批次一致性控制同一供体、同一时间分离、同一连续培养周期制备的细胞为1个批次，连续3个批次产品的活细胞率、表面标志物阳性率、分化能力的批间变异系数（CV）≤10%，方可认定工艺稳定。五、终产品质量控制5.1通用质控项目（所有脐带干细胞产品均需符合要求）1.身份溯源鉴定：采用短串联重复序列（STR）分型检测16个核心基因位点，与供体外周血STR分型匹配度为100%，排除细胞交叉污染、供体身份错配。2.细胞数量与活率：采用台盼蓝拒染法计数，活细胞率≥90%，总细胞数量满足临床使用要求，最低不少于1×10^6个/kg患者体重。3.纯度鉴定：采用流式细胞术检测，UC-MSC需符合ISCT标准：CD73、CD90、CD105阳性表达率≥95%，CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR阴性表达率≤2%；UCB-HSC：CD34+细胞占比≥2%，CD45+细胞占比≥90%，异体使用时CD3+T细胞占比≤0.1%，避免移植物抗宿主病。4.微生物安全性检测：无菌检查按照《中国药典》2020版三部无菌检查法开展，需氧菌、厌氧菌、真菌培养14天无生长；支原体采用培养法+荧光定量PCR法双检，结果均为阴性；内毒素采用鲎试剂法检测，含量≤0.5EU/mL；分枝杆菌采用液体培养法检测，培养42天无生长。5.遗传安全性检测：染色体核型G显带分析计数50个分裂相，核型为正常二倍体，染色体畸变率≤1%；致瘤性检测采用软琼脂克隆形成实验，克隆形成率≤0.01%，同时开展免疫缺陷小鼠异种移植实验，观察16周无肿瘤形成。6.效力检测：UC-MSC开展三系分化能力验证，成骨诱导21天茜素红染色阳性，成脂诱导14天油红O染色阳性，成软骨诱导21天阿尔新蓝染色阳性，分化率≥80%；UCB-HSC开展造血集落形成实验，CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM总集落数≥20个/1×10^5个细胞。7.残留物质检测：残留牛血清白蛋白含量≤50ng/mL，残留胰酶含量≤1μg/mL，残留青霉素/链霉素含量≤0.1μg/mL，残留外源基因组DNA含量≤10ng/剂，无制备过程中使用的载体、磁珠等异物残留。5.2分类专属质控项目1.冻存产品：冻存液采用临床级无DMSO或低DMSO（含量≤5%）配方，冻存复苏后活细胞率≥85%，复苏后置于2-8℃环境放置4h，活细胞率下降幅度≤10%。2.基因修饰脐带干细胞产品：额外开展基因修饰效率检测，目的基因表达率≥80%；采用全基因组测序检测脱靶效应，脱靶突变率≤0.1%，无致癌基因位点插入；基因整合位点分析验证整合位点位于非编码区，不影响内源基因表达。3.异体临床使用产品：额外开展免疫原性检测，UC-MSC混合淋巴细胞反应（MLR）中异体淋巴细胞增殖率≤10%；UCB-HSC需完成HLA-A、HLA-B、HLA-DR高分辨配型，6个位点中至少4个相合方可使用。六、储存、运输及放行质量控制6.1储存质控终产品需分装至2mL/5mL无菌冻存管中，每管标注唯一追溯码，采用程序降温法冻存，降温速率为1℃/min，降至-80℃后转移至液氮气相罐中长期储存，储存温度≤-150℃。液氮罐每15min自动记录一次内部温度，温度高于-140℃时立即触发声光报警，同一批次产品需分置于至少2个不同液氮罐中储存，避免单罐故障导致样本损失。储存期间每6个月抽检同一批次产品，活细胞率、表面标志物阳性率较冻存初期下降幅度≤5%，否则需启动该批次产品报废流程。6.2运输质控新鲜细胞产品采用2-8℃冷链运输，全程温度实时监控，运输时间≤6h，到达临床单位后活细胞率≥80%方可使用；冻存细胞产品采用干冰或液氮运输箱运输，全程温度≤-150℃，运输过程避免剧烈震动，到达后需核查温度记录完整无断点，复苏活细胞率≥80%方可使用。6.3放行标准所有质控项目全部合格，且制备过程记录完整、物料溯源清晰，由制备部门负责人、质量部门负责人双人签字后方可放行，放行资料包括供体筛查报告、制备过程记录、中间质控报告、终产品质控报告、储存运输记录，所有资料留存至产品使用后30年。七、追溯体系与不良反应监测质控7.1追溯体系每批次产品赋予唯一的电子追溯码，包含供体编号、制备批次、代次、冻存位置、放行日期、有效期等信息，实现从供体采集、制备、储存、运输、临床使用全链条双向追溯，可通过供体信息查询到所有使用该批次产品的患者，也可通过患者信息查询到对应产品的全流程质控记录。追溯系统数据定期备份，备份周期不超过7天，数据永久留存。7.2不良反应监测临床使用单位需在产品输注后72h、1个月、3个月、6个月、12个月开展定期随访，记录所有不良反应，包括发热、过敏、局部红肿、感染、移植物抗宿主病、肿瘤形成等。如同一批次产品不良反应发生率≥1%，立即启动产品召回，开展原因调查；如出现2例及以上严重不良反应（导致器官损伤、残疾、死亡），立即停止所有同批次、同供体来源产品的使用，开展全项复检，形成调查报告上报属地监管部门。八、方法学验证与变更控制8.1方法学验证所有质检方法需在正式使用前开展全项验证，验证内容包括准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性范围、耐用性