生物制品病毒检查指南（试行）

生物制品病毒检查指南（试行）1适用范围本指南适用于我国境内上市的预防类生物制品（病毒类疫苗、细菌类疫苗、联合疫苗等）、治疗类生物制品（血液制品、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、抗体偶联药物、细胞与基因治疗产品、溶瘤病毒产品等）、诊断类生物制品（体内用诊断试剂）从研发阶段、生产阶段、放行阶段到上市后监管阶段的病毒安全性检查工作，覆盖物料管控、生产过程控制、成品放行检测、风险处置全流程。2检查依据检查工作需严格遵循以下法规、标准及技术文件要求：2.1《中华人民共和国药品管理法》《中华人民共和国生物安全法》《药品生产监督管理办法》《生物制品批签发管理办法》；2.2《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及生物制品附录、细胞治疗产品附录、基因治疗产品附录；2.3《生物制品生产用细胞质量控制技术指导原则》《血液制品病毒去除/灭活工艺验证技术指导原则》《重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术指导原则》《细胞治疗产品质量控制研究技术指导原则》《基因治疗产品质量控制研究技术指导原则》《溶瘤病毒产品药学研究与评价技术指导原则》；2.4《中国药典（2020年版）》三部“生物制品生产用原材料质量控制要求”“外源病毒因子检查法”“病毒滴度测定法”“核酸扩增法检测外源病毒因子指导原则”相关要求。3检查基本要求3.1人员资质要求3.1.1现场检查及实验室检测人员需具备微生物学、病毒学、生物制药等相关专业本科及以上学历，具有3年以上生物制品生产、质量管控或病毒学检测实操经验；3.1.2所有参与检查人员需经过生物安全专项培训、病毒检测技术培训，考核合格后上岗，涉及高致病性病原微生物（如狂犬病病毒、新型冠状病毒、猴痘病毒等）操作的人员需持有对应生物安全等级实验室操作资质；3.1.3检查人员需主动申报与被检查单位的利益关联，存在直接利益关系的需执行回避制度。3.2场所与设备要求3.2.1病毒检测实验室需符合对应生物安全等级要求：检测普通灭活病毒、非高致病性活病毒的操作需在生物安全二级（BSL-2）及以上实验室开展，检测高致病性病原微生物的操作需在生物安全三级（BSL-3）及以上实验室开展；3.2.2核心检测设备需按周期校准，校准有效期不超过12个月：qPCR仪、数字PCR仪的荧光通道校准偏差≤0.5个CT值，细胞培养箱的温度控制偏差≤±0.5℃、CO₂浓度控制偏差≤±0.5%，超速离心机的转速偏差≤±1%，纳米滤膜完整性测试仪的泡点检测偏差≤±0.05MPa；3.2.3病毒检测用阳性对照品、标准品需溯源至中国食品药品检定研究院或国际标准物质库，工作对照品需经过量值溯源验证，滴度偏差≤±0.5log₁₀。3.3样品管理要求3.3.1取样操作需符合无菌操作要求，取样量需满足至少3次全项病毒检测的用量：细胞库样品取样量≥1×10⁷活细胞/份，生产收获液取样量≥100ml/份，成品取样量不少于法定检验用量的2倍；3.3.2样品运输需符合温控要求：2-8℃运输的样品全程温度偏差≤±2℃，运输时长不超过72小时；-20℃运输的样品全程温度偏差≤±3℃，运输时长不超过48小时；-70℃及以下温度运输的样品全程温度偏差≤±5℃，避免反复冻融；3.3.3样品留存期需符合要求：研发阶段样品留存至项目终止后5年，生产阶段中间品留存至对应批次产品放行后1年，成品留样留存至产品有效期后1年，无有效期产品留样留存至少30年。4核心检查内容4.1生产物料病毒安全性检查4.1.1细胞基质检查4.1.1.1三级细胞库（主细胞库MCB、工作细胞库WCB、生产终末细胞EOPC）的建立需符合GMP要求，传代代次清晰，溯源记录完整，生产终末细胞代次不得超过经验证的限传代次；4.1.1.2细胞库病毒检测项目需覆盖全部外源病毒因子：（1）通用检测项目：逆转录病毒检测（同时采用感染性试验、逆转录酶活性检测、透射电镜观察3种方法，感染性试验灵敏度≤1TCID₅₀/样，逆转录酶活性检测LOD≤10μU/ml）、支原体检测（同时采用培养法和核酸扩增法，培养法灵敏度≤10CFU/ml，核酸扩增法LOD≤10拷贝/反应）、无菌检查；（2）种属特异性病毒检测：啮齿类来源细胞（CHO、NS0、SP2/0等）需检测鼠细小病毒、汉坦病毒、鼠肝炎病毒、鼠逆转录病毒；猴源细胞（Vero、293T等）需检测猴空泡病毒40（SV40）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴T淋巴细胞白血病病毒（STLV）、猴痘病毒、猴疱疹病毒B；人源细胞（HEK293、CAR-T细胞等）需检测人类免疫缺陷病毒1/2型（HIV-1/2）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类嗜T淋巴细胞病毒1/2型（HTLV-1/2）、人细小病毒B19、EB病毒、巨细胞病毒（CMV）；（3）MCB、WCB需完成全项外源病毒检测，检测结果全部阴性方可投入使用，EOPC需每批次开展逆转录病毒、种属特异性病毒检测，检测合格方可进入下游工艺。4.1.2生产用原材料检查4.1.2.1动物来源原材料（胰蛋白酶、胎牛血清、胰蛋白胨、转铁蛋白等）需来自无疫区，具备官方检疫合格证明：牛来源原材料需来自无疯牛病（BSE）、口蹄疫疫区，检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛细小病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒全部阴性；猪来源原材料需来自非非洲猪瘟疫区，检测猪细小病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒全部阴性；4.1.2.2人来源原材料（人血清白蛋白、人血浆、人源细胞因子等）需具备来源筛查记录：献血员/供者需完成HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP检测全部阴性，混合原料需开展核酸检测，HBVDNA≤10IU/ml、HCVRNA≤10IU/ml、HIVRNA≤10IU/ml、人细小病毒B19DNA≤10⁴IU/ml方可投入使用；4.1.2.3培养基组分、生化试剂、一次性耗材需具备无外源因子污染的合格证明，直接接触产品的一次性耗材需经过γ射线辐照灭菌，灭菌剂量≥25kGy。4.1.3生产用毒种/载体检查4.1.3.1疫苗生产用毒种需建立三级种子库，检测无外源病毒污染，减毒活疫苗毒种需每5年开展一次毒力稳定性检测，传代过程中毒力回复突变率≤0.1%；4.1.3.2基因治疗产品用病毒载体（慢病毒、腺相关病毒、腺病毒等）需检测复制型病毒（RCL/RCA），每剂产品中复制型病毒含量≤1拷贝，溶瘤病毒产品需检测无外源病毒污染，病毒滴度符合质量标准要求。4.2生产过程病毒安全性控制检查4.2.1生产环境病毒污染防控检查4.2.1.1细胞培养区、病毒接种/收获区、活病毒操作区的洁净度等级需符合要求：静脉用生物制品生产对应区域洁净度为B级背景下的A级，肌肉注射用生物制品对应区域为C级背景下的A级；4.2.1.2高效空气过滤器（HEPA）每年至少开展1次检漏，检漏合格率100%，表面消毒工艺需经过病毒杀灭效果验证：75%乙醇对包膜病毒杀灭率≥99.99%，1000ppm次氯酸钠对非包膜病毒杀灭率≥99.9%，2000ppm次氯酸钠对高致病性病毒杀灭率≥99.99%；4.2.1.3不同品种、不同批次产品的生产区域需物理隔离，共用生产设备需开展清洁验证，病毒残留量≤1TCID₅₀/设备表面100cm²方可投入下一批次生产。4.2.2生产工艺病毒防控检查4.2.2.1病毒接种、细胞收获、产品纯化等核心工艺环节需采用密闭操作系统，取样操作采用密闭取样器，避免交叉污染，每批次生产收获液需开展外源病毒快速检测，检测阴性方可进入下游纯化工艺；4.2.2.2病毒去除/灭活工艺需经过验证，工艺变更、原材料变更、生产场地变更时需重新开展验证：（1）指示病毒选择需覆盖不同类型：至少包含2种包膜病毒（伪狂犬病毒PRV、BVDV、HIV等）、2种非包膜病毒（鼠细小病毒MVM、呼肠孤病毒3型、猪细小病毒PPV等），指示病毒滴度≥10⁶TCID₅₀/ml，加样体积不超过待验证样品体积的10%；（2）验证需采用最差工艺条件：低pH孵放验证选择最高允许pH值、最短孵放时间、最高蛋白浓度；S/D处理验证选择最低S/D浓度、最短处理时间、最低处理温度；纳米膜过滤验证选择最大过滤通量、最小滤膜孔径、最高蛋白浓度；（3）去除/灭活效果判定：单步工艺对包膜病毒的对数降低值（LRV）≥4log₁₀，对非包膜病毒的LRV≥3log₁₀，总工艺LRV≥12log₁₀，其中针对非包膜病毒的总LRV≥6log₁₀方可判定为符合要求。4.3成品病毒检查4.3.1检测项目确定需结合产品特性：灭活疫苗需开展活病毒残留检测，结果为阴性；减毒活疫苗需开展外源病毒检测、病毒滴度检测，滴度符合质量标准；血液制品需开展HBV、HCV、HIV的抗原/抗体及核酸检测，人细小病毒B19核酸≤10⁴IU/ml；细胞与基因治疗产品需开展复制型病毒检测、外源病毒检测，结果为阴性；4.3.2检测方法需经过验证/确认：采用药典收载方法的需开展方法适用性确认，采用自建方法的需完成全项验证，其中核酸扩增法（qPCR/ddPCR）的特异性≥100%、检测限（LOD）≤10拷贝/反应、精密度CV≤5%、回收率80%-120%；感染性试验的特异性≥100%、检测限≤1TCID₅₀/样、精密度偏差≤0.5log₁₀；4.3.3检测操作需设置对照：每次检测需同时设置空白对照、阴性样品对照、阳性对照，空白对照、阴性对照全部阴性，阳性对照检出率100%方可判定检测结果有效，每批次样品需做2份平行检测，平行样结果偏差≤0.5log₁₀方可报告结果；4.3.4阳性结果处置：初检出现阳性结果的需第一时间启动偏差调查，首先排查实验室污染：采集操作台、移液器、离心机、耗材、试剂样本开展检测，确认无实验室污染后重新取样复测，复测仍为阳性的判定为产品不合格，需同步启动生产全流程溯源调查。4.4偏差与风险处置检查4.4.1病毒污染偏差需在24小时内上报属地药品监管部门，偏差调查需覆盖物料来源、生产环境、工艺操作、检测全流程，明确根本原因，制定的纠正预防措施（CAPA）需可落地，连续3批产品病毒检测全部合格后方可恢复正常生产；4.4.2上市后产品发现病毒安全风险的需在72小时内启动召回，一级召回（存在严重致死风险）需在10日内完成全部召回工作，二级召回（存在严重健康风险）需在20日内完成全部召回工作，三级召回（存在一般风险）需在30日内完成全部召回工作，召回产品需经过121℃高压灭菌30分钟以上无害化处理，处理记录留存至少5年；4.4.3病毒污染事件处置完成后需形成风险评估报告，上报国家药品监督管理局及国家疾控中心，涉及公众健康风险的需及时向社会发布风险提示。5特殊产品补充检查要求5.1细胞与基因治疗产品：自体细胞产品需核查供者病毒筛查记录，涵盖HIV-1/2、HBV、HCV、HTLV-1/2、EBV、CMV、梅毒螺旋体全部阴性；异体CAR-T产品需开展EBV、CMV的激活检测，病毒载量≤100拷贝/μg核酸方可放行；5.2mRNA疫苗：需核查体外转录用酶、核苷酸、帽类似物的外源病毒检测报告，成品需开展活病毒残留检测、宿主细胞残留DNA检测，残留DNA片段长度≤200bp、含量≤10ng/剂；5.3血液制品：每批混浆池的血浆份数不超过10000份，混浆需开展2遍核酸检测，HBVDNA≤10IU/ml、HCVRNA≤10IU/ml、HIVRNA≤10IU/ml，生产工艺需包含至少2种针对非包膜病毒的去除/灭活步骤。6检查结果应用6.1产品放行判定：病毒检查全部项目符合质量标准的产品方可放行，批签发机构需逐批核查病毒检测原始记录，不符合要求的不予批签发；6.2监管处置：检查发现存在病毒安全隐患的，依法采取暂停生产、暂停销售使用、责令召回等控制措施，违反《药品管理法》《生物安全法》规定的，处货值金额15倍以上30倍以下罚款，情节严重的吊销药品生产许可证，相关责任人终身禁止从事药品生产经营活动，构成犯罪