生物制品镉盐测定指南（试行）

生物制品镉盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、血液制品类、重组蛋白/抗体类、细胞治疗产品类、基因治疗产品类、体外诊断试剂类生物制品及其原辅材料、生产用水、中间品、成品中镉盐残留的定量测定。本指南收录的石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）定量限为0.001mg/kg（固体基质）、0.0003mg/L（液体基质），电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）定量限为0.0003mg/kg（固体基质）、0.0001mg/L（液体基质），可覆盖各类生物制品的镉残留限量要求。2规范性引用文件下列文件对于本指南的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本指南；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本指南。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB5009.15-2014食品安全国家标准食品中镉的测定《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0406原子吸收分光光度法《中华人民共和国药典》2025年版四部通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测GMP（2010年修订）药品生产质量管理规范3术语和定义3.1镉盐残留：指生物制品生产过程中由原辅材料、生产设备、工艺用水、包装材料引入的游离态、结合态镉及其化合物的总残留量，以镉元素计。3.2基质效应：样品基质中除待测物外的其他组分对测定信号的增强或抑制作用，可导致测定结果偏差。3.3检出限（LOD）：指在给定的置信水平下，能够定性检出样品中待测物的最低浓度或含量，本指南以7次试剂空白测定值的标准偏差的3倍对应的浓度为检出限。3.4定量限（LOQ）：指在给定的置信水平下，能够准确定量样品中待测物的最低浓度或含量，本指南以7次试剂空白测定值的标准偏差的10倍对应的浓度为定量限。4方法原理4.1石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）样品经消解处理后，其中的镉盐转化为可溶性镉离子，将消解液注入石墨炉原子化器，经干燥、灰化、原子化阶段，镉元素在高温下解离为基态原子，对镉空心阴极灯发射的228.8nm特征谱线产生选择性吸收，在一定浓度范围内，吸光度值与镉浓度成正比，采用外标法或标准加入法定量。4.2电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）样品经消解处理后，待测液经载气引入电感耦合等离子体中，在约7000K高温下被电离为带正电荷的镉离子，经离子传输系统进入质量分析器，按照质荷比（111Cd、114Cd）进行分离，其离子信号强度与样品中镉浓度成正比，采用内标法校正基质效应和仪器漂移，实现定量测定。5仪器与试剂耗材5.1试剂耗材5.1.1实验用水：符合GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm，全程使用无镉污染的实验用水。5.1.2硝酸：电子级或优级纯，镉本底值≤0.01μg/L，优先使用同一批次硝酸以降低本底波动。5.1.330%过氧化氢：优级纯，镉本底值≤0.01μg/L。5.1.4磷酸二氢铵-硝酸钯基体改进剂：称取0.15g优级纯硝酸钯，加入1mL硝酸低温溶解后，加入1.0g优级纯磷酸二氢铵，用一级水定容至100mL，4℃避光保存，有效期3个月。5.1.5镉标准储备液：1000μg/mL，有证国家标准物质，证书在有效期内。5.1.6铟标准储备液：1000μg/mL，有证国家标准物质，作为ICP-MS测定用内标。5.1.7耗材：聚四氟乙烯消解罐、无重金属聚乙烯移液枪头、无重金属聚乙烯容量瓶、无重金属采样管、瓷坩埚（干法灰化用）。所有接触样品的器皿使用前需经20%（V/V）硝酸溶液浸泡≥24h，取出后用一级水冲洗6次以上，烘干后密封保存，每批次浸泡的器皿随机抽取5%进行本底抽检，镉含量不得高于方法检出限的1/3。5.2仪器设备5.2.1石墨炉原子吸收光谱仪：配置镉空心阴极灯、热解涂层石墨管、自动进样器、背景校正系统（氘灯或塞曼校正）。5.2.2电感耦合等离子体质谱仪：配置碰撞反应池、高盐进样系统、自动进样器。5.2.3微波消解仪：配置温度、压力控制系统，最高工作温度≥200℃，最高工作压力≥1500psi。5.2.4控温赶酸器：温控范围室温~200℃，控温精度±5℃。5.2.5马弗炉：温控范围室温~1000℃，控温精度±10℃。5.2.6电子天平：分度值0.1mg，经计量检定合格。5.2.7低温高速离心机：最高转速≥10000r/min。所有仪器设备需经计量检定合格，且在有效期内使用，每次实验前需对仪器性能进行验证。6样品采集与保存6.1采样要求采样过程严格避免镉污染，所有采样工具、容器均为无重金属材质，不得接触任何金属部件。6.1.1液体生物制品：包括疫苗原液、血液制品、重组蛋白注射液、细胞培养液、工艺用水等，采样前将样品充分混匀，涉及无菌样品的需在二级生物安全柜内操作，取样量不少于10mL，若待测样品镉含量接近定量限可适当增加取样量至20~50mL，取样后立即密封，标注样品编号、品名、批次、采样日期、采样人。6.1.2固体生物制品：包括冻干粉针、蛋白胨、酵母提取物、药用辅料等，采用非金属取样勺取至少3个不同部位的样品混合均匀，取样量不少于1g，冻干粉针需加入适量一级水完全溶解后再进行前处理。6.1.3半固体生物制品：包括凝胶类制剂、脂质体制剂、微球制剂等，采样时避免分层，取混匀后样品不少于0.5g。6.2样品保存常温稳定的样品可在25℃以下避光保存；热不稳定样品需在2~8℃保存，保存期不超过7天；需长期保存的样品可置于-20℃冷冻保存，避免反复冻融，冷冻样品测定前需室温自然解冻，充分混匀后取样。7分析步骤7.1样品前处理每批次样品同步做至少2份全程试剂空白，空白值不得高于方法定量限的1/3，否则需排查污染来源后重新实验。7.1.1微波消解法（首选方法）准确称取混匀后的样品，固体样品0.2~0.5g（精确至0.1mg），液体样品1~5mL（精确至0.01mL）置于消解罐内，含乙醇、甘油等有机溶剂的样品需先置于80℃水浴挥去有机溶剂，避免消解时压力过高。向消解罐内加入5mL硝酸、2mL过氧化氢，加盖密封后放入微波消解仪，按照表1程序进行消解：表1微波消解程序步骤温度（℃）爬升时间（min）保持时间（min）112055216051031905207.1.2干法灰化法（适用于高有机质样品）准确称取混匀后的样品0.5~1.0g（精确至0.1mg）置于瓷坩埚内，先置于电热板上120℃小火炭化至无烟，然后转移至马弗炉内，500℃灰化4~6h，冷却后取出，若残渣仍有黑色炭粒，加入1mL硝酸浸润后置于电热板上蒸干，再次放入马弗炉500℃灰化1h，冷却后取出，加入1mL50%（V/V）硝酸溶液溶解灰分，转移至10mL容量瓶中用1%硝酸定容，混匀后待测。灰化温度不得超过550℃，否则镉元素会高温挥发导致回收率偏低。7.1.3湿法消解法（适用于无法使用微波消解的实验室）准确称取样品0.5~1.0g（精确至0.1mg）置于玻璃消解管内，加入10mL硝酸-高氯酸混合液（4:1，V/V），加盖后冷消化过夜，次日置于150℃电热板上消解，待溶液变为无色透明且冒高氯酸白烟时，赶酸至剩余约0.5mL，冷却后用1%硝酸转移至10mL容量瓶定容，混匀后待测。消解过程需设置通风橱防护，避免高氯酸爆炸。7.2标准系列配制7.2.1GFAAS标准系列将镉标准储备液用1%硝酸逐级稀释至1μg/L标准使用液，按照0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0μg/L的浓度梯度配制标准系列，若样品基质效应较强，需采用空白基质（经测定不含镉的同类型样品基质）配制基质匹配标准系列，消除基质干扰。每个标准点使用前加入5μL磷酸二氢铵-硝酸钯基体改进剂。7.2.2ICP-MS标准系列将镉标准储备液用1%硝酸逐级稀释至10μg/L标准使用液，按照0、0.1、0.5、1.0、2.0、10.0μg/L的浓度梯度配制标准系列，内标溶液为10μg/L铟溶液，采用在线加入方式或手动加入到所有标准、样品、空白溶液中，内标加入浓度保持一致。7.3测定7.3.1GFAAS测定按照表2设置仪器参数，预热仪器30min，待基线稳定后依次测定试剂空白、标准系列、样品溶液，每个样品平行进样2次，取吸光度平均值，标准曲线相关系数r≥0.995方可使用，若相关系数不达标需重新配制标准系列。表2GFAAS测定参数项目参数测定波长228.8nm灯电流3~5mA狭缝宽度0.5nm背景校正氘灯或塞曼校正干燥阶段110℃保持20s，130℃保持10s灰化阶段450℃保持20s原子化阶段1800℃保持3s（停气）净化阶段2400℃保持2s进样量20μL样品+5μL基体改进剂按照表3设置仪器参数，预热仪器30min，使用调谐液对仪器灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等参数进行调谐，满足要求后依次测定试剂空白、标准系列、样品溶液，每个样品平行进样2次，取信号平均值，标准曲线相关系数r≥0.999方可使用，同时监测111Cd、114Cd两个同位素，两个同位素测定值偏差≤10%方可采用，若偏差过大需排查干扰。表3ICP-MS测定参数项目参数射频功率1550W载气流量1.0L/min辅助气流量0.8L/min冷却气流量15L/min碰撞气氦气，流量4.5mL/min监测离子111Cd、114Cd，内标115In积分时间0.1s/质量数进样量100μL/min样品中镉盐残留量（以镉元素计）按照下式计算：X=(C-C₀)×V×f/(m×1000)式中：X——样品中镉的含量，单位为mg/kg（固体）或mg/L（液体）；C——样品测定液中镉的浓度，单位为μg/L；C₀——试剂空白中镉的浓度，单位为μg/L；V——样品消解液定容体积，单位为mL；f——样品稀释倍数（若消解后进行稀释则代入，否则为1）；m——样品取样量，单位为g（固体）或mL（液体）；1000——单位换算系数。结果保留两位有效数字，若测定值低于检出限，表述为“未检出”，并注明方法检出限；若测定值在检出限和定量限之间，表述为“<定量限值”；若测定值高于定量限，报出实际测定值。9方法学性能验证要求实验室正式采用本方法前需进行方法学验证，满足以下指标要求方可使用：9.1检出限与定量限连续测定7次试剂空白，计算浓度标准偏差，3倍标准偏差对应的浓度为方法检出限，10倍标准偏差对应的浓度为方法定量限，需满足：GFAAS检出限≤0.0003mg/L（液体）、≤0.001mg/kg（固体）；ICP-MS检出限≤0.0001mg/L（液体）、≤0.0003mg/kg（固体）。9.2精密度同一操作人员对同一份高、中、低三个浓度水平的样品平行测定6次，相对标准偏差（RSD）≤10%；不同操作人员、不同时间测定同一份样品的RSD≤15%。9.3准确度采用加标回收法验证，分别在样品中加入定量限、2倍限量值、10倍限量值三个水平的镉标准品，每个水平做3份平行样，加标回收率需在80%~110%范围内。若采用有证标准物质验证，测定值需在证书标示值的不确定度范围内。10质量控制要求10.1内部质量控制10.1.1每批次样品需带至少2份全程试剂空白，空白值不得超过方法检出限的1/3，否则需排查试剂、器皿、环境的镉污染。10.1.2每测定10个样品需插入1份中间浓度标准品进行校核，测定值与标示值的偏差不得超过±10%，若超出偏差范围需重新绘制标准曲线，并对之前测定的样品进行重新测定。10.1.3每批次样品需带至少1份基质加标样，加标回收率需在80%~110%范围内，若回收率不达标需排查基质效应或样品损失问题。10.1.4每季度至少测定1次镉含量有证标准物质，测定值需在证书不确定度范围内，验证方法准确性。10.1.5所有实验记录需符合GMP要求，包括样品信息、仪器型号、试剂批号、标准品证书编号、消解程序、仪器参数、标准曲线、原始数据、计算过程、结果判定、实验人员、审核人员等，记录保存期限不少于产品有效期后1年，且不少于5年。10.2外部质量控制实验室每年至少参加1次国家或行业组织的镉测定能力验证或实验室间比对，结果满意方可持续开展检测工作。11镉残留限量要求各类生物制品及其原辅材料的镉残留需符合以下要求，若产品注册标准有更严格要求的，执行注册标准：11.1生产用原辅材料：蛋白胨、酵母提取物、发酵用原料等≤0.3mg/kg；药用辅料、化学原料药≤0.2mg/kg；生产工艺用水≤0.0005mg/L。11.2中间品：各类生物制品中间品≤0.1mg/kg（或mg/L）。11.3成品：疫苗、血液制品、重组蛋白/抗体制剂、基因治疗产品≤0.05mg/L；细胞治疗产品成品、细胞冻存液≤0.03mg/kg；体外诊断试剂核心反应组分≤0.5mg/kg；外用生物制剂≤0.3mg/kg。12注意事项12.1污染防控：镉的环境本底极低，实验过程需严格防控污染，实验人员需佩戴无粉乳胶手套，穿着无金属装饰的实验服，不得佩戴金属首饰；实验台面需预先用1%硝酸擦拭干净，实验过程避免灰尘落入样品；尽量使用同一批次试剂，降低本底波动。12.2干扰消除：GFAAS测定高盐、高蛋白基质样品时，若标准加入法回收率仍不达标，可适当提高灰化温度至500℃，延长灰化时间，或采用塞曼背景校正消除基质干扰；ICP-MS测定时，若114Cd受到114Sn同量异位素干扰，可选择111Cd作为定量同位素，或采用碰撞反应池模式消除干扰。12.3样品损失防控：消解过程不得将消解液完全蒸干，干法灰化温度不得超过500℃，避免镉高温挥发；含络合态镉的样品需保证消解完全，若消