生物制品汞盐测定指南（试行）

生物制品汞盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于未添加汞类防腐剂（如硫柳汞、硝酸苯汞等）的预防类生物制品（疫苗、类毒素等）、治疗类生物制品（抗毒素、抗血清、血液制品、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、基因治疗产品、细胞治疗产品等）、体外诊断试剂用生物原料中残留汞盐（含无机汞、有机汞总残留量）的测定，本指南方法检出限可满足现行《中华人民共和国药典》生物制品汞残留限量要求。对于添加汞类防腐剂的生物制品，其总汞及游离汞测定可参考本指南前处理及仪器测定方法，结合品种特性调整前处理流程。2规范性引用文件下列文件对于本指南的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本指南；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本指南。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则1101生物制品残留量测定法GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南GBZ/T213-2008血源性病原体职业接触防护导则HJ694-2014水质汞、砷、硒、铋和锑的测定原子荧光法HJ700-2014水质65种元素的测定电感耦合等离子体质谱法3术语和定义3.1汞盐残留指生物制品生产过程中由原辅料、生产设备、生产工艺引入的无机汞、有机汞总残留量，不含处方中刻意添加的汞类防腐剂。3.2方法检出限指通过特定前处理及测定流程，能够定性检出样品中汞残留的最低浓度，以3倍连续11次试剂空白测定值的标准偏差计算。3.3方法定量限指能够准确定量样品中汞残留的最低浓度，以10倍连续11次试剂空白测定值的标准偏差计算，其测定结果的精密度、准确度应满足分析要求。3.4基质效应指样品中除目标物外的其他基质成分对汞测定信号的增强或抑制效应。4原理本指南包含两种测定方法，第一法为原子荧光光谱法（AFS），为常规检测首选方法；第二法为电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），为仲裁及低含量残留检测方法。4.1原子荧光光谱法样品经微波消解或湿法消解处理，将有机汞全部转化为无机汞，在酸性介质中，汞离子被硼氢化钾或硼氢化钠还原为原子态汞，由载气（氩气）带入原子化器中，在汞空心阴极灯特定波长的光照射下，基态汞原子被激发至高能态，在去活化回到基态时发射出特征波长的荧光，其荧光强度与汞含量成正比，采用外标法定量。4.2电感耦合等离子体质谱法样品经消解处理后，由载气带入电感耦合等离子体中，经高温电离形成离子，经离子传输系统进入质谱仪，按照质荷比进行分离，测定汞同位素（²⁰²Hg）的信号强度，信号强度与汞含量成正比，采用外标法或内标法定量。5试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为优级纯及以上纯度，实验用水符合GB/T6682-2008规定的一级水要求，所有试剂使用前均需进行汞本底检测，空白值低于方法检出限方可使用。5.1硝酸：优级纯，必要时经亚沸蒸馏提纯，降低汞本底。5.2盐酸：优级纯，必要时经亚沸蒸馏提纯。5.330%过氧化氢：优级纯。5.4氢氧化钾：优级纯。5.5硼氢化钾（或硼氢化钠）：分析纯及以上纯度。5.6重铬酸钾：优级纯。5.7汞标准储备液：国家有证标准物质，浓度为1000mg/L，有效期1年，4℃避光保存。5.8汞标准中间液：移取100μL汞标准储备液，用5%（v/v）硝酸+0.05%（w/v）重铬酸钾溶液定容至100mL，得到浓度为1mg/L的中间液，4℃避光保存，有效期1个月。5.9汞标准工作液：移取适量汞标准中间液，用5%硝酸+0.05%重铬酸钾溶液逐级稀释至所需浓度，现配现用。5.10内标标准储备液：国家有证标准物质，铑（¹⁰³Rh）或铟（¹¹⁵In）标准溶液，浓度为1000mg/L。5.11内标工作液：移取适量内标标准储备液，用5%硝酸溶液稀释至浓度为10μg/L，现配现用。5.12硼氢化钾还原液：称取0.5g氢氧化钾溶解于100mL一级水中，加入1g硼氢化钾，搅拌溶解，现配现用，浓度为10g/L，可根据仪器灵敏度调整浓度在1~2g/L范围内。5.13载流液：5%（v/v）硝酸溶液。5.1420%硝酸浸泡液：量取200mL优级纯硝酸，用一级水定容至1000mL，用于器皿浸泡。5.15载气：氩气，纯度≥99.999%。5.16实验器皿：所有接触样品、试剂的器皿均为聚丙烯或聚四氟乙烯材质，使用前经20%硝酸浸泡24h以上，用一级水冲洗3次后烘干备用，禁止使用含汞的橡胶塞、乳胶管、皮筋等接触样品或试剂。6仪器设备6.1通用设备6.1.1电子天平：分度值0.0001g。6.1.2微波消解仪：配聚四氟乙烯消解罐，最高工作温度≥200℃。6.1.3赶酸仪：温控精度±5℃，最高温度≥200℃。6.1.4超纯水仪：出水电阻率≥18.2MΩ·cm。6.1.5可调式移液器：量程覆盖10μL~10mL。6.2原子荧光光谱法专用设备原子荧光光度计，配置汞空心阴极灯。6.3电感耦合等离子体质谱法专用设备电感耦合等离子体质谱仪，配置碰撞反应池，可监测²⁰²Hg、¹⁰³Rh、¹¹⁵In同位素。6.4仪器校准要求所有计量器具应按照国家计量检定规程要求定期校准，微波消解仪应每6个月进行一次温度示值误差校准，原子荧光光度计、电感耦合等离子体质谱仪应每年进行一次性能校准。每次实验前应对仪器灵敏度、精密度进行核查：AFS汞元素0.1μg/L标准溶液的荧光强度值应不低于100，连续测定7次0.1μg/L汞标准溶液的相对标准偏差（RSD）应≤3%；ICP-MS测定0.1μg/L汞标准溶液的信噪比应≥10，连续测定7次的RSD应≤5%。7样品采集与保存7.1采样器具：采用无汞聚丙烯材质的采样管、移液枪头，预处理流程同5.16要求，禁止使用含汞材质的器具接触样品。7.2采样量：每批样品采集不少于2份平行样，每份样品量不少于2mL（液体样品）或0.5g（冻干样品），同时采集同批次采样空白（以一级水代替样品，与样品同流程采样、保存、处理）。7.3样品保存：采样后若24h内无法完成测定，应向样品中加入优级纯硝酸调节pH至2以下，再加入0.05%（w/v）重铬酸钾，密封后置于4℃避光保存，保存期不超过7d，禁止冷冻保存，避免蛋白质变性导致汞吸附沉降。8分析步骤8.1样品前处理8.1.1微波消解法（首选）称取液体样品0.5~2g（或移取0.5~2mL）、冻干样品0.1~0.5g（精确至0.0001g），置于聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL硝酸、1mL30%过氧化氢，盖紧罐盖后室温预消解30min，蛋白含量高的样品（如血液制品、重组蛋白药物）预消解时间延长至1h，若产生大量泡沫可加入1滴辛醇消泡。将消解罐放入微波消解仪中，按照表1程序进行消解：表1微波消解升温程序步骤升温时间（min）目标温度（℃）保持时间（min）151205251505310180208.1.2湿法消解法（无微波消解设备时使用）称取与微波消解法等量的样品置于50mL硬质玻璃三角瓶中，加入10mL硝酸、2mL30%过氧化氢，盖上表面皿，置于赶酸仪上120℃加热消解，若溶液变棕褐色可补加适量硝酸，直至溶液澄清无色或淡黄色，继续加热至剩余液体约2mL，停止加热，冷却至室温后转移至25mL容量瓶，后续定容流程同8.1.1。消解过程中禁止将溶液蒸干，若出现蒸干情况应弃去样品重新处理。8.2标准曲线制备8.2.1原子荧光光谱法标准曲线移取适量汞标准工作液，用5%硝酸+0.05%重铬酸钾溶液配制浓度为0.00μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L的标准系列溶液，现配现用。8.2.2电感耦合等离子体质谱法标准曲线移取适量汞标准工作液，用5%硝酸+0.05%重铬酸钾溶液配制浓度为0.00μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.2μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的标准系列溶液，现配现用。8.3仪器测定8.3.1原子荧光光谱法测定按照仪器说明书开机预热，设置仪器工作参数：灯电流15~25mA，负高压260~300V，原子化器温度200℃，载气流量300~400mL/min，屏蔽气流量800~1000mL/min，读数时间10s，延迟时间1s。待仪器稳定后，依次测定标准系列溶液、试剂空白、样品溶液，以荧光强度为纵坐标、汞浓度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线相关系数应≥0.999。每测定10个样品插入1次中间浓度标准溶液核查，测定值与标示值的偏差应≤±5%，若超出范围应重新绘制标准曲线后再测定。8.3.2电感耦合等离子体质谱法测定按照仪器说明书开机预热，设置仪器工作参数：射频功率1550W，载气流量1.0~1.2L/min，辅助气流量0.8L/min，冷却气流量15L/min，氦碰撞气流量4.5mL/min，采样深度8~10mm。仪器优化完成后，在线加入内标工作液，依次测定标准系列溶液、试剂空白、样品溶液，以²⁰²Hg与内标信号的比值为纵坐标、汞浓度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线相关系数应≥0.999。每测定10个样品插入1次中间浓度标准溶液核查，测定值与标示值的偏差应≤±5%，若超出范围应重新绘制标准曲线后再测定。测定高浓度样品后，采用5%硝酸+0.05%半胱氨酸溶液冲洗进样系统5~10min，消除汞的记忆效应。8.4结果计算样品中汞盐残留量按式（1）计算：ω=(ρ-ρ₀)×V×f/m（1）式中：ω——样品中汞盐残留量，单位为μg/kg（固体样品）或μg/L（液体样品）；ρ——样品溶液中汞的测定浓度，单位为μg/L；ρ₀——试剂空白中汞的测定浓度，单位为μg/L；V——样品溶液定容体积，单位为mL；f——样品稀释倍数；m——样品称样量（固体样品，单位为g）或移取体积（液体样品，单位为mL）。9质量控制9.1批次质量控制9.1.1空白控制：每批样品的试剂空白值应低于方法定量限的1/10，采样空白值应低于方法检出限，若空白值超标，应排查试剂、器皿、环境的污染来源，重新处理样品。9.1.2平行样控制：平行样测定结果的相对偏差应≤10%，若超出范围应重新测定。9.1.3准确度控制：每批样品应同步测定1份有证基质标准物质，或进行1次基质加标回收试验，加标浓度为样品预估浓度的0.5~2倍，加标回收率应在80%~110%范围内，基质标准物质测定值应在证书给出的不确定度范围内。9.1.4仪器稳定性控制：按8.3要求开展中间浓度标准溶液核查，偏差超标时重新绘制标准曲线。9.2年度质量控制实验室每年至少参加1次国家或行业组织的汞残留测定能力验证，结果满意方可继续开展检测工作。10污染防控与职业防护10.1实验室要求：汞测定应设置独立的前处理室和仪器室，禁止与其他使用汞的实验（如汞滴定法、冷原子吸收测汞等）同区域开展，实验室墙面、台面应采用耐腐蚀、易清洁的材质，定期用10%硝酸溶液擦拭，降低环境本底。10.2职业防护：实验人员应按照GBZ/T213要求穿戴一次性丁腈手套、防护服、防护口罩，禁止在实验区域进食、饮水，实验结束后及时清洁双手，若皮肤接触汞废液应立即用大量清水冲洗，严重者及时就医。10.3废弃物处理：实验产生的含汞废液、废弃样品应收集于专用密封聚乙烯容器中，加入过量硫化钠溶液使汞生成硫化汞沉淀，上清液汞含量低于0.05mg/L后方可排入污水处理系统，沉淀部分交由具备危险废物处理资质的单位处置；实验用过的器皿经20%硝酸浸泡24h后冲洗干净方可重复使用，废弃的枪头、采样管等固体废弃物按危废统一处理。11方法验证要求实验室首次使用本指南方法开展检测前，应按照GB/T27417要求完成方法验证，验证指标包括：（1）线性范围：相关系数应≥0.999；（2）检出限与定量限：检出限应≤0.01μg/L，定量限应≤0.03μg/L，满足对应生物制品的限量要求；（3）精密度：6次平行测定的RSD应≤10%；（4）准确度：加标回收率应在80%~110%范围内，基质标准物质测定值符合证书要求；（5）基质效应：采用基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值评价基质效应，比值在0.8~1.2范围内说明基质效应可接受，若超出范围应采用基质匹配标准曲线或标准加入法定量。12结果判定与报告12.1测定结果低于方法检出限时，表述为“未检出（<检出限值）”；测定结果在检出限与定量限之间时，表述为“<定量限值”；测定结果高于定量限时，按照实际测定值报告，保留1~2位有效数字。12.2结果判定应符合对应生物制品的质量标准要求，未规定具体限值的生物制品，可参照《中华人民共和国药典》2025年版三部要求，汞残留量不得过50μg/L。1