生物制品活性测定指南（试行）

生物制品活性测定指南（试行）本指南适用于疫苗、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、细胞因子类制品、血液制品、基因治疗产品、细胞治疗产品等各类型生物制品的生物学活性测定工作，覆盖研发阶段质量研究、中试生产过程质控、上市后批次放行、稳定性考察及上市后不良反应溯源全流程的活性检测需求，所有开展生物制品活性测定的研发机构、生产企业、第三方检测机构及监管部门相关检测实验室均需参照本指南执行。第一章基本原则1.1特异性原则：活性测定方法需特异性响应目标生物制品的生物学功能，排除制品中其他辅料、工艺相关杂质、产品相关杂质及样本基质的干扰，与同家族同源序列分子的交叉反应率不得高于0.5%，阴性对照（空白基质、无活性突变体、无关同型对照）的响应值不得高于本底响应的120%。1.2量效关系一致性原则：待测样品的剂量-响应曲线斜率需与活性标准品的曲线斜率无统计学差异（F检验P>0.05），方可采用平行对照法计算相对活性，不得采用外推法计算超曲线范围的样品活性。1.3准确度与精密度平衡原则：优先选择准确度高、精密度好的体外测定方法，体内测定方法仅在无可用体外方法时采用，需通过合理设置样本重复、动物组规模控制测定误差。1.4合规性原则：活性测定方法需经过完整的方法学验证后方可用于批次放行检测，验证数据需留存备查，涉及注册申报的活性测定数据需符合《药品注册管理办法》《生物制品注册分类及申报资料要求》相关规定。第二章测定方法分类与适用场景2.1体外活性测定法2.1.1细胞功能测定法：包含细胞增殖/抑制法、细胞杀伤法、细胞因子诱导释放法三类。①细胞增殖/抑制法：适用于细胞因子、生长因子、免疫抑制剂类制品的活性测定，操作要求为：目标细胞接种密度控制在1×10^4~5×10^4个/mL，接种时细胞活率≥95%，传代次数不得超过限定代次（通常≤30代），培养时间根据细胞周期设置为24~72h，采用CCK-8、MTT或台盼蓝染色法检测细胞活力，CCK-8检测波长为450nm、参比波长630nm，MTT检测波长为570nm、参比波长630nm，复孔变异系数（CV）需≤10%。②细胞杀伤法：适用于CAR-T、CAR-NK、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒类制品的活性测定，采用LDH释放法、荧光标记靶细胞法或报告基因法检测，效靶比设置为1:1、3:1、10:1、30:1共4个梯度，孵育时间为4~24h，靶细胞自发释放率不得超过最大释放率的15%。③细胞因子诱导释放法：适用于免疫调节剂、疫苗类制品的免疫原性测定，采用流式细胞术或CBA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子的分泌水平，细胞刺激时间为16~48h，每个样本至少检测1×10^4个活细胞。2.1.2结合活性测定法：适用于抗体、受体类、疫苗抗原类制品的活性测定，包含ELISA法、表面等离子共振（SPR）法、生物层干涉（BLI）法三类。①ELISA法：包被抗原/抗体浓度为1~10μg/mL，封闭液采用5%脱脂奶或1%BSA，孵育时间为1~2h，样本稀释梯度至少设置5个，批内CV≤10%，批间CV≤15%。②SPR/BLI法：配体固定密度控制在100~500RU（SPR）或0.5~2nm（BLI），分析物浓度梯度设置为KD值的0.1、0.2、0.5、1、2、5、10倍共7个梯度，结合时间为60~300s，解离时间为300~600s，采用1:1结合模型拟合的R²≥0.98，KD值测定偏差≤±2倍。2.1.3报告基因测定法：适用于抗体ADCC/CDC活性、信号通路调节剂、中和抗体类制品的活性测定，采用稳定转染荧光素酶或荧光蛋白报告基因的细胞系，细胞接种密度为2×10^4~1×10^5个/孔，诱导时间为4~24h，荧光素酶检测的信号本底比≥5倍，相对活性测定CV≤15%。2.1.4酶促反应测定法：适用于溶栓类、凝血因子类、酶替代治疗类制品的活性测定，采用底物显色法或凝胶电泳法，反应温度控制在37℃±0.5℃，反应时间偏差≤±5%，活性回收率在80%~120%之间，CV≤10%。2.2体内活性测定法适用于无可用体外活性测定方法的疫苗、重组蛋白类制品，包含攻毒保护试验、动物模型药效试验两类。2.2.1攻毒保护试验：适用于预防性疫苗的效力测定，每组实验动物数量小鼠≥10只、大鼠≥8只、豚鼠≥6只、大动物≥3只，免疫程序设置为1~3针，免疫剂量梯度至少4个，攻毒剂量为半数致死量（LD50）或半数感染量（TCID50）的100~1000倍，采用Reed-Muench法或Karber法计算半数有效剂量（ED50），平行测定的ED50偏差≤±0.5个log值，保护率计算偏差≤±10%。2.2.2动物模型药效试验：适用于治疗性生物制品的体内活性验证，采用符合研究要求的疾病模型动物，每组动物数≥6只，给药剂量梯度至少3个，药效终点指标的组间差异需具有统计学意义（P<0.05），相对活性测定偏差≤±20%。2.3替代活性测定法指经过方法学验证、与体内/复杂体外活性测定法线性相关系数R²≥0.95的简化测定方法，仅可用于生产过程中间产物质控、快速稳定性筛查，不得用于最终批次放行，替代方法的测定结果出现异常时，需采用原方法进行复核。第三章方法学验证要求所有用于批次放行的活性测定方法需开展完整的方法学验证，验证内容及可接受标准如下：3.1专属性：验证空白基质、工艺相关杂质（宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、残留抗生素）、产品相关杂质（聚体、降解片段、突变体）对测定结果的干扰，干扰率≤10%，无关对照品的交叉反应率≤0.5%，阳性对照回收率在80%~120%之间。3.2准确性：采用加样回收法验证，设置高、中、低三个浓度水平（分别为活性范围上限、中点、下限），每个浓度至少开展3次独立重复试验，体外法回收率需在80%~120%之间，体内法回收率可放宽至70%~130%，浓度-回收率线性相关系数R²≥0.98。3.3精密度：包含批内精密度、批间精密度、日间精密度、人员比对精密度4个维度，批内精密度为同一批次样品同一检测人员同一块板测定6次，CV≤10%；批间精密度为同一批次样品不同批次试剂、不同板测定6次，CV≤15%；日间精密度为同一批次样品连续3天测定，CV≤15%；人员比对精密度为2名及以上检测人员测定同一样品，结果相对偏差≤15%；体内法精密度可放宽为批内CV≤20%、批间CV≤25%。3.4线性与范围：剂量-响应曲线采用四参数Logistic拟合时拟合优度R²≥0.98，采用线性拟合时R²≥0.99；测定范围需覆盖制品放行标准的70%~130%区间，最低定量限（LOQ）的回收率≥80%、CV≤20%，最高定量限（ULOQ）的回收率≤120%、CV≤20%。3.5耐用性：验证微小操作变动下的测定结果稳定性，变动条件包括孵育时间±10%、孵育温度±2℃、试剂批次更换、移液器误差±5%、不同型号检测设备，各条件下测定结果相对偏差≤15%。3.6稳定性指示能力：验证方法能够区分活性降解的样品，强制降解样品（60℃放置7天、反复冻融3次、pH值±2处理1h）的活性测定值与未降解样品偏差≥20%，可有效指示制品活性变化。3.7再验证要求：当制品生产工艺发生变更、测定试剂关键组分发生变更、设备更换或测定地点转移时，需开展部分或完整方法学再验证，确保方法性能符合要求。第四章标准品的使用与管理4.1标准品分级与溯源：分为一级国家标准品、企业内部一级标准品、工作标准品三级。一级国家标准品需溯源至中国食品药品检定研究院或世界卫生组织（WHO）发放的法定标准品，无法定标准品的需自行制备企业内部一级标准品，经3家及以上具备资质的实验室联合标定，标定总CV≤10%，赋值95%置信区间≤±10%，活性赋值经过验证后方可使用；工作标准品需采用一级标准品进行标定，至少开展3次独立标定，标定CV≤10%，赋值偏差≤±5%。4.2标准品储存与维护：标准品需按照验证后的条件储存，一级标准品需长期保存在-80℃及以下温度，工作标准品可保存在-20℃或-80℃，储存过程中避免反复冻融；标准品需定期复标，一级标准品每2年复标1次，工作标准品每6个月复标1次，复标活性与原赋值偏差≥5%时需重新赋值。4.3标准品使用要求：每次活性测定需同时检测标准品，标准品剂量-响应曲线拟合优度符合要求后方可计算样品活性；标准品复溶严格按照说明书操作，复溶后2~8℃放置不得超过24h，-20℃冻存不得超过1个月，反复冻融不得超过2次。第五章常规测定操作规范5.1样品处理：待测样品需按照规定条件运输、储存，检测前平衡至室温（20~25℃）10~30min，3000~5000rpm离心5~10min去除沉淀，采用与标准品相同的稀释液进行梯度稀释，稀释后样品浓度需落在测定线性范围内，不得采用超范围外推法计算活性。5.2测定过程控制：每个样品至少设置2个复孔，高变异样品需设置3个复孔，复孔CV≤10%否则该组数据作废；每块检测板需同时设置空白对照、阴性对照、阳性对照，对照测定值需落在预先设定的质控范围内，否则整板数据作废；细胞测定用细胞系需无支原体、外源病毒污染，传代次数在限定代次以内，使用前活率≥95%。5.3结果计算：采用标准品平行对照法计算相对活性，不得采用单点法计算（经方法学验证单点法偏差≤10%的除外）；样品响应值需落在标准品剂量-响应曲线的线性区间内，结果保留至整数或小数点后1位，根据制品精度要求确定。5.4记录管理：实时记录所有操作信息，包括样品编号、批号、生产批次、标准品批号与代次、细胞系代次、试剂批号、设备编号、孵育时间、温度、检测原始数据、计算过程、检测人员、检测日期，所有记录需可追溯，保存期限符合GMP要求，至少至制品有效期后1年。第六章异常情况处理与偏差调查6.1常见异常情况：包括标准曲线拟合优度不合格、复孔CV超标、对照值超出质控范围、样品活性超出放行标准。6.2初步排查流程：出现异常情况时首先排查操作层面原因，包括加样错误、孵育时间/温度偏差、试剂污染/过期、细胞活率不足、样品反复冻融/降解，确认属于操作失误的，作废该次测定，重新检测，原始异常数据需留存不得销毁。6.3偏差调查要求：排除操作失误后需启动正式偏差调查，调查范围覆盖样品生产、储存、运输全流程，设备校准状态、试剂有效性、标准品活性状态均需纳入调查内容，偏差调查需形成书面报告，明确偏差原因，制定纠正预防措施（CAPA）并跟踪落实。6.4方法复核要求：偏差原因为方法本身性能不足的，需暂停该方法的使用，开展方法优化和再验证，验证合格后方可重新投入使用。第七章不同类别生物制品活性测定特殊要求7.1疫苗类制品：灭活疫苗、减毒活疫苗的放行活性测定采用体内效力试验或经验证的体外抗原含量测定法，ED50测定偏差≤±0.5个log值，抗原含量测定CV≤15%；mRNA疫苗需额外检测体外翻译效率，转染293T细胞后抗原表达量CV≤15%，假病毒中和抗体滴度测定CV≤20%；重组疫苗的抗原结合活性测定R²≥0.98，相对活性80%~120%。7.2重组蛋白与细胞因子类制品：干扰素、促红素、集落刺激因子等采用细胞增殖法测定活性，EC50偏差≤±20%，相对活性放行标准为80%~120%；酶替代治疗类制品采用酶促反应法测定，活性回收率80%~120%，CV≤10%。7.3单克隆抗体类制品：靶点结合活性采用SPR/BLI法测定，KD值偏差≤±2倍；ADCC/CDC活性采用报告基因法测定，诱导倍数≥5倍，相对活性80%~120%；中和抗体类采用病毒中和试验测定，IC50偏差≤±2倍。7.4血液制品类：凝血因子Ⅷ/Ⅸ采用一期法或二期法测定活性，回收率80%~120%，CV≤10%；静注人免疫球蛋白的病原体中和抗体滴度不得低于法定标准要求，测定CV≤15%；白蛋白的胶体渗透压活性测定偏差≤±10%。7.5细胞与基因治疗产品：CAR-T细胞的杀伤活性采用LDH释放法或报告基因法测定，效靶比10:1时杀伤率≥40%，CV≤20%；腺相关病毒（AAV）产品的转导活性采用转染293T细胞后目的基因表达量测定，转导效率≥30%，表达量CV≤15%；溶瘤病毒的溶瘤活性采用肿瘤细胞杀伤试验测定，MOI=1时杀伤率≥30%，CV≤15%。第八章稳定性考察与质量合规要求8.1稳定性考察测定要求：加速稳定性、长期稳定性、强制降解稳定性、使用中稳定性考察的活性测定需采用同一批次工作标准品，减少测定系统误差；长期稳定性测定时间点为0、3、6、9、12、18、24、36个月（根据制品有效期调整），各时间点活性与0天相比偏差≤±20%，超出范围需及时调查原因，评估制品有效期合理性；加速稳定性（25℃、60%相对湿度）放置6个月活性下降率≤10%，否则需优化储存条件。8.2质量