生物制品水分测定指南（试行）

生物制品水分测定指南（试行）1适用范围本指南适用于境内生产、检验、监管环节涉及的疫苗类、抗毒素及抗血清类、血液制品类、重组生物制品类、微生态制剂类、体外诊断用生物试剂类等生物制品的水分测定，涵盖冻干制剂、生物原料药、药用辅料、半固体制剂、包装材料残留水分等检测场景。本指南不适用于含有大量挥发性有机组分且无法扣除干扰的特殊生物制品，该类制品可参考本指南制定专项检测方案。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0832水分测定法GB/T6283-2008化工产品中水分含量的测定卡尔·费休法（通用方法）GB/T606-2003化学试剂水分测定通用方法卡尔·费休法和重量法WHO《生物制品质量控制指南（2023版）》《药品质量标准分析方法验证指导原则》（中国药典2025年版四部通则9101）《生物制品安全管理规程》（国家药监局2022年发布）3术语和定义3.1水分：本指南中所指水分为生物制品中存在的游离水及弱结合水总和，制品配方中明确添加的结晶水组分不计入水分含量范围，特殊品种另有规定的从其规定。3.2干燥失重法：通过常压或减压条件下加热使样品中水分及可挥发性组分逸失，以减失重量占样品初始重量的比例表征水分含量的方法，若样品中存在非水挥发性组分，测定结果为干燥失重量。3.3卡尔·费休法：基于碘、二氧化硫在碱性介质和醇类溶剂中与水发生定量化学反应的原理，通过滴定剂消耗量或电解电量计算水分含量的方法，分为容量法与库仑法两类。3.4甲苯蒸馏法：利用水与甲苯共沸的特性将样品中水分分离，通过接收管中分层水的体积计算水分含量的方法。3.5恒重：指样品经连续两次干燥或灼烧后，称量差异≤0.3mg的状态，微量水分测定场景下恒重差异可放宽至≤0.1mg。4基本要求4.1人员要求从事生物制品水分测定的人员需经过专项操作培训，掌握不同测定方法的原理、操作流程、误差控制要点及生物安全防护要求，熟悉生物制品特性，持有检验岗位上岗资质，考核合格后方可独立开展检测工作。4.2环境要求开展水分测定的实验室环境温度需控制在18℃~26℃，相对湿度控制在30%~50%RH，避免阳光直射及空气对流。卡尔·费休法检测区域需远离水源、蒸汽发生装置，避免环境水分引入检测误差；涉及易燃易爆试剂（甲苯、甲醇）的操作需在防爆通风橱内开展。4.3设备与试剂要求4.3.1计量类设备（分析天平、恒温干燥箱、卡尔·费休滴定仪、真空压力表、蒸馏装置刻度接收管）需经过法定计量部门校准，校准证书在有效期内，设备使用前需开展性能确认：干燥箱需完成温度分布验证，工作区域温度波动不超过±2℃；卡尔·费休滴定仪需完成漂移测试，基线漂移值≤10μg/min方可开展检测。4.3.2试剂需符合对应检测方法的纯度要求，基准试剂需具备溯源性，卡尔·费休试剂、甲苯等试剂需按照说明书要求储存，临用前需进行空白值验证，超过有效期或空白值超标的试剂不得使用。4.4样品要求取样需符合《生物制品取样规程》要求，涉及无菌、感染性样品的取样需在生物安全柜内开展，避免样品污染或病原微生物扩散。样品需密封储存，临用前开封，开封后立即完成取样称量，避免环境水分吸附导致误差。取样量需满足检测限要求：干燥失重法取样量需保证减失重量≥1mg；卡尔·费休法取样量需保证待测水分含量落在仪器线性范围内；甲苯法取样量需保证接收管中水体积≥0.5ml。5测定方法及操作规范5.1干燥失重法5.1.1常压干燥法原理：样品在105℃常压下干燥至恒重，减失的重量主要为水分及少量挥发性组分，通过重量差计算水分占比。适用范围：适用于热稳定性好、不含挥发性有机溶剂、不含结晶水的生物制品，如灭活疫苗冻干辅料、铝佐剂干粉、体外诊断用酶标抗原冻干品等；不适用于热敏感、易氧化、含挥发性组分的制品。仪器与试剂：电热恒温鼓风干燥箱（控温精度±1℃）、万分之一分析天平（精度0.1mg）、玻璃干燥器（填充变色硅胶或五氧化二磷干燥剂）、扁形玻璃称量瓶；干燥剂（变色硅胶、五氧化二磷）。操作步骤：1.称量瓶恒重：将洗净的称量瓶瓶盖斜支于瓶边，置于105℃烘箱中干燥2h后取出，盖好瓶盖移入干燥器中冷却30min，精密称定重量；重复干燥1h、冷却、称重操作，直至两次称量差异≤0.3mg即为恒重，记录称量瓶恒重值W0。2.样品测定：取混合均匀的样品1~2g（含水量<0.5%的样品可增加取样量至5g），平铺于已恒重的称量瓶中，样品厚度≤5mm，松散样品厚度≤10mm，精密称定称量瓶加样品的总重量W1。将称量瓶瓶盖斜支后置于105℃烘箱中干燥4h，取出后盖好瓶盖移入干燥器冷却30min，精密称重；重复干燥1h、冷却、称重操作，直至恒重，记录干燥后总重量W2。结果计算：干燥失重（%）=（W1-W2）/(W1-W0)×100%注意事项：1.干燥器内干燥剂需定期更换，变色硅胶变色占比超过1/2时需更换，五氧化二磷表面出现结块时需更换；2.含铝佐剂的样品干燥时间需延长至6h，避免内部水分未完全逸失导致结果偏低；3.若样品干燥后出现焦化、颜色加深等热降解现象，需立即停止检测，改用减压干燥法。5.1.2减压干燥法原理：在减压条件下（压力≤2.67kPa，即20mmHg）降低水的沸点，在60~80℃温度下将样品干燥至恒重，通过重量差计算水分占比。适用范围：适用于热敏感、易氧化、含水量低的生物制品，如减毒活疫苗冻干品、重组细胞因子冻干品、冻干人免疫球蛋白等；不适用于熔融温度低于干燥温度的制品。仪器与试剂：减压干燥箱（控温精度±2℃，真空度可调）、真空泵、真空表（精度1kPa）、万分之一分析天平、干燥器、扁形称量瓶；干燥剂（五氧化二磷、无水氯化钙）。操作步骤：1.称量瓶恒重：将称量瓶瓶盖斜支放入减压干燥箱，开启真空泵抽真空至压力≤2.67kPa，温度设定为60℃（特殊制品可调整至70℃或80℃，需在操作规程中明确），干燥2h后缓慢通入干燥氮气至常压，取出称量瓶移入干燥器冷却30min，精密称重；重复干燥至恒重，记录W0。2.样品测定：取混合均匀的样品0.5~1g平铺于已恒重的称量瓶中，精密称定总重量W1后放入减压干燥箱，瓶盖斜支，抽真空至≤2.67kPa后开启加热，保持设定温度干燥3h后关闭加热，缓慢通入干燥氮气至常压，取出移入干燥器冷却30min，精密称重；重复干燥至恒重，记录W2。结果计算：同常压干燥法注意事项：1.抽真空和放气速度需控制在1L/min以内，避免样品被气流吹散导致重量损失；2.减压干燥箱内需放置足量五氧化二磷干燥剂，吸收逸出的水分，避免干燥箱内湿度过高影响干燥效果；3.对于含蔗糖、甘露醇等冻干保护剂的样品，需预实验确认干燥温度不会导致样品熔融，若出现熔融现象需降低干燥温度5~10℃。5.2卡尔·费休法基本原理：碘与二氧化硫在吡啶、甲醇存在下与水发生定量反应：I₂+SO₂+3C₅H₅N+CH₃OH+H₂O=2C₅H₅N·HI+C₅H₅N·HSO₄CH₃，通过碘的消耗量计算水分含量，1mol碘与1mol水定量反应。5.2.1容量法卡尔·费休适用范围：适用于含水量0.1%~10%的生物制品，如大部分冻干生物制品、生物原料药、半固体制剂等；含醛酮组分的样品需使用醛酮专用卡尔·费休试剂，避免缩醛反应生成水导致结果偏高。仪器与试剂：卡尔·费休容量滴定仪（滴定精度0.01ml）、万分之一分析天平、磁力搅拌器、密封滴定杯；通用型/醛酮专用卡尔·费休试剂（滴定度2~5mgH₂O/ml，有效期3个月）、无水甲醇（含水量≤0.05%）、酒石酸钠二水合物（基准试剂，理论含水量15.66%，用于滴定度标定）。操作步骤：1.滴定度标定：向滴定杯中加入20~30ml无水甲醇，开启搅拌，用卡尔·费休试剂滴定至电位突变且保持30s不变（扣除甲醇空白）。精密称取酒石酸钠二水合物10~20mg，快速加入滴定杯中，搅拌溶解后滴定至终点，记录消耗试剂体积V。平行标定3次，RSD≤1.0%为合格，滴定度T（mg/ml）=（m×15.66%×1000）/V，其中m为酒石酸钠称样量。2.样品测定：重新滴定甲醇空白至终点后，精密称取适量样品（预计含水量2~5mg，如含水量1%的样品称取0.2~0.5g），快速加入滴定杯中，搅拌溶解后滴定至终点，记录消耗试剂体积V样。平行测定2次，RSD≤2.0%为合格。对于不溶性样品，可加入10~20ml甲酰胺作为助溶剂，助溶剂需预先做空白校正；含铝佐剂、细胞碎片等难溶组分的样品，可采用卡氏炉进样，设置加热温度105~150℃，高纯氮气载气流量40~60ml/min，将蒸发的水分带入滴定池测定。结果计算：水分（%）=（T×V样）/(m样×1000)×100%，其中m样为样品称样量。注意事项：1.每次测定前需重新标定滴定度，若环境温度变化超过5℃或更换试剂批次，需重新标定；2.滴定杯需密封良好，避免环境水分进入，连续使用超过24h需更换滴定杯内的溶剂。5.2.2库仑法卡尔·费休原理：电解阳极产生的碘与水发生定量反应，根据电解消耗的电量计算水分含量，1mg水对应10.72库仑电量。适用范围：适用于含水量≤0.1%的微量水分测定，如生物制品用药用丁基胶塞残留水分、超高纯度重组蛋白原料药、极低含水量冻干制品的测定。仪器与试剂：卡尔·费休库仑滴定仪（水分检测精度1μg）、卡氏炉（可选）、十万分之一分析天平；库仑法阳极液、阴极液（含水量≤10μg/ml）。操作步骤：1.仪器校准：向滴定池中加入对应体积的阳极液和阴极液，开启仪器电解至基线稳定，注入10μl纯水（精密称定）测定回收率，回收率在98%~102%之间为合格。2.样品测定：精密称取适量样品（预计含水量10~100μg），快速加入滴定池中，若为不溶性或热敏性样品，采用卡氏炉进样，设置加热温度120℃，载气流量50ml/min，测定至终点，记录水分质量m水。平行测定2次，RSD≤3.0%为合格。结果计算：水分（%）=m水/m样×100%注意事项：1.库仑法试剂使用周期不超过1个月，当阳极液出现浑浊或基线漂移值超过20μg/min时需更换试剂；2.取样量需严格控制，避免含水量超过滴定池最大测定负荷（一般为10mg水）。5.3甲苯蒸馏法原理：水与甲苯共沸，共沸点为84.1℃，低于水的沸点，蒸馏出的水分与甲苯在接收管中静置分层，根据水层体积计算水分含量。适用范围：适用于含高油脂、挥发性组分、易氧化的生物制品，如兽用油佐剂疫苗、含脂类血液制品原料等。仪器与试剂：水分测定蒸馏装置（含500ml蒸馏瓶、直形冷凝管、分度值0.05ml的刻度接收管）、控温电热套、万分之一分析天平；甲苯（分析纯，预先用水饱和后分去水层，蒸馏纯化后使用）。操作步骤：1.仪器预处理：将蒸馏装置所有部件洗净烘干，避免水分残留。2.样品测定：取适量样品（预计含水量2~4ml，如油佐剂疫苗称取20~50g），精密称定后放入蒸馏瓶中，加入200ml甲苯及数粒沸石，连接冷凝管与接收管，从冷凝管顶端加入甲苯至充满接收管刻度部分，开启加热，控制蒸馏速度2~5ml/min，直至接收管中水量不再增加、冷凝管内壁无水滴附着，停止加热。用少量甲苯冲洗冷凝管，使附着的水滴全部流入接收管，静置10min待分层完全后，读取水层体积V（单位ml，水密度按1g/ml计算）。结果计算：水分（%）=V/m样×100%注意事项：1.甲苯属于易燃易爆有毒试剂，操作需在防爆通风橱内开展，避免明火接触；2.若出现乳化分层不清晰的情况，可加入0.5~1ml无水乙醇促进分层，或放入低速离心机以1000r/min离心2min后读取体积。6方法学验证要求首次采用的测定方法需按照《药品质量标准分析方法验证指导原则》开展验证，验证内容包括：6.1专属性：确认样品中辅料、活性成分不会与检测试剂发生反应，不会干扰水分测定。卡尔·费休法需做空白辅料回收率试验，回收率在95%~105%之间为无干扰；干燥失重法需确认非水挥发性组分含量低于水分的1%，否则需标注结果为干燥失重量。6.2线性：卡尔·费休法需覆盖检测限至标准限度120%的范围，线性相关系数r≥0.999；干燥失重法、甲苯法可结合回收率验证线性。6.3准确度：采用加样回收法测定，含水量≥0.1%的样品回收率需在95%~105%之间，含水量<0.1%的微量样品回收率可放宽至90%~110%。6.4精密度：重复性：6份平行样品测定结果RSD≤2.0%，微量水分测定RSD≤3.0%；中间精密度：不同人员、不同设备、不同日期测定的结果RSD≤3.0%。6.5检测限与定量限：干燥失重法检测限0.05%、定量限0.1%；容量法卡尔·费休检测限0.01%、定量限0.05%；库仑法卡尔·费休检测限0.001%、定量限0.005%；甲苯法检测限0.1%、定量限0.5%。6.6耐用性：考察温度波动±5℃、湿度波动±10%RH、取样量波动±20%等条件下，测定结果RSD≤3.0%。7结果判定与报告要求7.1结果判定：测定结果需符合对应品种的注册质量标准，如冻干减毒活疫苗水分一般≤3.0%、冻干人血白蛋白水分≤1.0%、体外诊断冻干试剂水分≤5.0%。若测定结果超出标准范围，需重新取样复检，复检需采用两种不同原理的方法交叉验证，两种方法结果均超出范围的判定为不合格。7.2报告要求：检测报告需注明测定方法、环境温湿度、设备编号、试剂批号、测定日期、测定人、复核人等信息；结果有效数字需与质量标准精度一致，含水量≥1%的保