生物制品碳酸盐测定指南（试行）

生物制品碳酸盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于pH值在5.5~8.5区间的生物制品原液、成品、生产用缓冲液及原辅材料中总碳酸盐（含游离碳酸根CO₃²⁻、碳酸氢根HCO₃⁻、溶解态CO₂，总含量以Na₂CO₃计）的定量测定；不适用于含碳酸酯类共价结合物、可在酸性条件下分解释放CO₂的非碳酸盐类基质样品的测定。生产过程中间控制可选择快速检测方法，注册检验、上市后监督抽检需采用经方法学验证的法定检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件：《中国药典2025年版三部总则》、GB/T601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》、GB/T27407-2010《实验室质量控制规范理化检测》、WHO《生物制品质量控制指南（2023版）》。3术语和定义3.1总碳酸盐：指样品中游离碳酸根、碳酸氢根、溶解态二氧化碳的总和，以无水碳酸钠的质量浓度或质量分数表示。3.2空白校正：指扣除测定体系中试剂、环境溶解CO₂引入的碳酸盐本底值的操作，所有测定结果均需经过空白校正。3.3方法检出限（LOD）：指特定测定方法下可定性检出样品中碳酸盐的最低浓度，定量限（LOQ）指可准确定量的最低浓度，LOQ需满足回收率90%~110%、精密度RSD≤10%的要求。4方法选择原则根据样品基质复杂度、碳酸盐含量区间选择适配的测定方法：4.1酸碱滴定法：适用于碳酸盐含量≥100μg/mL、基质简单的样品（如生产用缓冲液、高浓度原液、原辅材料），操作简便、成本低、准确度高，适合生产过程中间控制。4.2离子色谱法：适用于碳酸盐含量1μg/mL~1000μg/mL的样品（如成品制剂、低浓度原液），灵敏度高、特异性好，为生物制品注册检验首选方法。4.3顶空气相色谱法：适用于碳酸盐含量0.1μg/mL~500μg/mL、基质复杂的样品（如疫苗、血液制品、重组蛋白制剂，含高浓度蛋白/核酸/多糖基质），基质干扰小，灵敏度最高。5通用操作要求所有方法均需遵守以下通用要求，避免环境或试剂引入的CO₂干扰：5.1试剂要求：所有试剂为优级纯及以上级别，实验用水为无CO₂水，制备方法为将电阻率≥18.2MΩ·cm的超纯水煮沸15min，密闭冷却至室温，临用新制；所有试剂配制后立即密封，4℃避光保存，避免接触空气。5.2器具要求：所有玻璃器具、进样瓶使用前需经10%（v/v）优级纯盐酸浸泡24h，再用无CO₂水冲洗6次以上，105℃烘干后密闭存放，避免吸附空气中的CO₂。5.3环境要求：实验区域相对湿度≤60%，温度控制在20℃±2℃，避免人员频繁走动，操作需在密闭通风橱内进行，操作人员需佩戴口罩，避免呼出气体直接接触样品或试剂。5.4样品采集与保存：样品采集后立即密封，4℃避光保存，24h内完成测定；如需长期保存需-20℃冻存，避免反复冻融，测定前恢复至室温后立即开瓶处理，开瓶后放置时间不得超过5min。6酸碱滴定法操作规程6.1原理样品中碳酸盐与过量盐酸标准溶液反应生成CO₂，煮沸除去全部CO₂后，用氢氧化钠标准滴定液回滴过量盐酸，根据酸碱消耗量差值计算总碳酸盐含量，反应式如下：CO₃²⁻+2H⁺=CO₂↑+H₂OHCO₃⁻+H⁺=CO₂↑+H₂OH⁺（过量）+OH⁻=H₂O6.2试剂与材料6.2.1无CO₂水；6.2.20.1mol/L盐酸标准滴定液：按GB/T601-2016要求制备与标定，扩展不确定度≤0.2%；6.2.30.1mol/L氢氧化钠标准滴定液：按GB/T601-2016要求制备，临用前标定，扩展不确定度≤0.2%；6.2.4甲基橙-溴甲酚绿混合指示剂：1份0.1%甲基橙乙醇溶液与3份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀，变色范围pH3.8（黄绿）~pH5.1（蓝绿）。6.3仪器设备6.3.1电子分析天平：精度0.1mg，计量校准有效期内；6.3.2酸式/碱式滴定管：50mL，A级，计量校准有效期内；6.3.3电热恒温水浴锅：控温精度±1℃；6.3.4具塞锥形瓶：250mL；6.3.5电位滴定仪（可选）：精度0.01pH单位，适用于有色样品测定。6.4操作步骤6.4.1样品前处理：准确移取VmL样品（碳酸盐含量约0.1~10mg，可根据含量调整取样量，不足20mL用无CO₂水补至20mL）置于250mL具塞锥形瓶中；若样品pH<4.0，预先用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0后再进行后续操作。6.4.2滴定：准确加入20.00mL0.1mol/L盐酸标准滴定液，摇匀后立即置于沸水浴中加热10min，确保CO₂完全逸出，取出后立即用流水冷却至室温，加入3滴混合指示剂，用氢氧化钠标准滴定液滴定至溶液由紫红色变为蓝绿色，保持30s不褪色即为终点，记录消耗氢氧化钠溶液体积V₁（mL）。若样品颜色较深无法观察指示剂变色，采用电位滴定法，滴定终点为pH=5.1。6.4.3空白试验：用等体积无CO₂水代替样品，按上述相同步骤操作，记录消耗氢氧化钠溶液体积V₀（mL）。6.5结果计算液体样品总碳酸盐含量（以Na₂CO₃计，单位：μg/mL）计算公式如下：X=[(V₀-V₁)×C(NaOH)×53.00×1000]/V式中：C(NaOH)为氢氧化钠标准滴定液的实际浓度，单位mol/L；53.00为1/2Na₂CO₃的摩尔质量，单位g/mol；1000为单位换算系数；V为取样体积，单位mL。若为固体样品，取样量为m（单位：g），结果单位为μg/g，分母替换为m即可。6.6性能要求与注意事项6.6.1方法检出限为50μg/mL，定量限为100μg/mL；6.6.2平行样相对偏差≤2.0%，加标回收率为95%~105%；6.6.3加热煮沸时间不得少于8min、不得超过15min，避免水分过度蒸发导致结果偏差；6.6.4滴定过程需在1min内完成，避免环境CO₂溶解进入溶液导致结果偏高。7离子色谱法操作规程7.1原理样品经稀释、除蛋白预处理后，通过阴离子交换色谱柱分离，碳酸盐经抑制型电导检测器检测，外标法定量。7.2试剂与材料7.2.1无CO₂水；7.2.2碳酸盐标准储备液：准确称取1.0000g经280℃烘干至恒重的基准无水碳酸钠，用无CO₂水溶解定容至1000mL，浓度为1000μg/mL（以Na₂CO₃计），密封4℃保存，有效期1个月；7.2.3标准工作液：临用前将储备液用无CO₂水逐级稀释为0μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL、1000.0μg/mL的系列标准溶液；7.2.4淋洗液：4.5mmol/LNa₂CO₃+0.8mmol/LNaHCO₃混合溶液，经0.22μm水相微孔滤膜过滤，超声脱气15min后使用；若采用氢氧根淋洗液体系，需使用淋洗液发生器，淋洗液为20mmol/LKOH，可降低碳酸盐本底；7.2.5再生液：50mmol/L硫酸溶液；7.2.610%（w/v）三氯乙酸溶液：优级纯三氯乙酸用无CO₂水配制，临用新制。7.3仪器设备7.3.1离子色谱仪：配有抑制型电导检测器，阴离子交换色谱柱，柱温可控；7.3.2高速冷冻离心机：转速≥12000r/min，控温精度±1℃；7.3.30.22μm水相微孔滤膜：无碳酸盐本底，一次性使用；7.3.4OnGuardAg预处理柱（可选）：用于去除高浓度氯离子干扰。7.4操作步骤7.4.1样品前处理：①缓冲液、无蛋白样品：准确移取VmL样品，用无CO₂水稀释至合适浓度，经0.22μm滤膜过滤后待测；②含蛋白样品（蛋白浓度≥1mg/mL）：准确移取VmL样品，加入等体积10%三氯乙酸溶液，涡旋混匀1min，4℃静置10min沉淀蛋白，12000r/min4℃离心15min，取上清液用无CO₂水稀释至合适浓度，经0.22μm滤膜过滤后待测；若样品中氯离子浓度≥1000μg/mL，需经OnGuardAg柱预处理去除氯离子后再进样。7.4.2色谱条件：色谱柱为DionexIonPacAS23阴离子交换柱（250mm×4mm），配套保护柱DionexIonPacAG23（50mm×4mm）；柱温30℃；淋洗液流速1.0mL/min；进样体积25μL；抑制器电流45mA（氢氧根体系为75mA）。系统适用性要求：碳酸盐峰与相邻杂质峰分离度≥1.5，拖尾因子0.9~1.1，理论塔板数≥5000。7.4.3标准曲线绘制：将系列标准工作液按浓度从低到高依次进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数r≥0.999。7.4.4样品测定：将处理后的样品进样，记录峰面积，代入标准曲线计算样品中碳酸盐浓度C₁（μg/mL），同时做空白试验，记录空白浓度C₀（μg/mL）。每10个样品插入1个中间浓度质控样，质控样测定值与真值偏差≤±5%，否则需重新绘制标准曲线。7.5结果计算液体样品总碳酸盐含量（以Na₂CO₃计，单位：μg/mL）计算公式如下：X=(C₁-C₀)×D/V式中：D为样品稀释倍数；V为取样体积，单位mL。若为固体样品，取样量为m（单位：g），定容体积为V总（单位：mL），结果单位为μg/g，公式调整为X=(C₁-C₀)×D×V总/m。7.6性能要求与注意事项7.6.1方法检出限为0.3μg/mL，定量限为1.0μg/mL；7.6.2平行样相对偏差≤3.0%，加标回收率为92%~108%；7.6.3淋洗液需全程密封，避免与空气接触，每24h更换一次淋洗液；7.6.4蛋白沉淀步骤需严格控制温度在4℃，避免碳酸盐分解释放CO₂导致结果偏低。8顶空气相色谱法操作规程8.1原理样品中碳酸盐在酸性条件下完全转化为CO₂，顶空进样后经气相色谱柱分离，采用热导检测器（TCD）或配甲烷转化炉的氢火焰离子化检测器（FID）检测，外标法定量。8.2试剂与材料8.2.1无CO₂水；8.2.21mol/L硫酸溶液：优级纯硫酸用无CO₂水配制，煮沸冷却后密封保存；8.2.3碳酸盐标准储备液：同离子色谱法；8.2.4标准工作液：临用前稀释为0μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL、10.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL的系列浓度溶液；8.2.520mL顶空瓶：配套聚四氟乙烯/硅橡胶密封垫，使用前120℃烘烤2h，冷却后密闭存放，密封垫一次性使用。8.3仪器设备8.3.1气相色谱仪：配有顶空进样器、热导检测器（TCD）或配甲烷转化炉的氢火焰离子化检测器（FID）；8.3.2色谱柱：PorapakQ填充柱（2m×3mm）或PlotQ毛细管柱（30m×0.32mm×10μm）；8.3.3电子分析天平：精度0.1mg，计量校准有效期内。8.4操作步骤8.4.1样品前处理：准确移取1.0mL样品于预先烘干的20mL顶空瓶中，立即加入1.0mL1mol/L硫酸溶液，3s内完成顶空瓶密封，涡旋混匀30s。8.4.2顶空条件：平衡温度60℃，平衡时间15min，定量环温度70℃，传输线温度80℃，加压时间0.2min，进样时间0.5min。8.4.3色谱条件：柱温120℃（若样品有机酸含量≥100μg/mL，采用程序升温：初始50℃保持2min，10℃/min升至150℃保持5min，避免有机酸干扰）；检测器温度200℃（TCD）/250℃（FID）；载气为高纯氦气（TCD可选用高纯氢气，灵敏度更高），流速2.0mL/min；分流比5:1。系统适用性要求：CO₂峰理论塔板数≥1000，与相邻杂质峰分离度≥2.0。8.4.4标准曲线绘制：取1.0mL系列标准工作液按上述相同步骤处理进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数r≥0.998。8.4.5样品测定：同法处理样品进样，记录峰面积，代入标准曲线得样品浓度C₁（μg/mL），同时做空白试验得C₀（μg/mL）。8.5结果计算稀释倍数为2（加入硫酸体积），计算公式同离子色谱法。8.6性能要求与注意事项8.6.1方法检出限为0.03μg/mL，定量限为0.1μg/mL；8.6.2平行样相对偏差≤4.0%，加标回收率为90%~110%；8.6.3硫酸加入后需快速密封顶空瓶，避免CO₂逸出导致结果偏低；8.6.4高黏度样品可预先用无CO₂水稀释2~5倍后再处理，避免基质效应影响结果准确性。9质量控制要求9.1人员要求：操作人员需经过生物制品理化检验专项培训，考核合格后上岗，熟悉方法原理、操作要点与生物安全防护要求。9.2试剂质控：每批试剂需进行空白本底测定，空白碳酸盐含量不得高于对应方法LOD的1/3，否则需更换试剂或重新制备无CO₂水；标准物质需使用有证基准物质，扩展不确定度≤0.1%，在有效期内使用。9.3批次检测质控：每批次检测需同时开展空白试验、平行样试验、加标回收试验，平行样相对偏差、加标回收率需符合对应方法的性能要求；每20个样品插入1个有证质控样，质控样测定值与标示值偏差≤±5%，否则该批次样品需重新测定。9.4方法验证要求：新开展检测项目或更换方法、试剂、仪器时，需进行完整的方法学验证，验证内容包括专属性、线性、范围、重复性、中间精密度、准确度、检出限、定量限，验证结果符合要求后方可用于样品检测。10结果判定与报告要求10.1结果判定：测定结果低于LOD的，报告为“<方法检出