生物制品铁盐测定指南（试行）

生物制品铁盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素及抗血清类、重组治疗性蛋白类、血液制品类、细胞治疗产品类、体外诊断试剂类生物制品的原液、半成品、成品的铁盐限量检查及定量测定。对于活性成分本身含配位结合铁的生物制品（如铁偶联抗体、含铁酶类制品等），需根据活性成分特性调整前处理及测定方法，不直接适用本指南。本指南包含硫氰酸盐比色法、原子吸收分光光度法两类测定方法，实验室可根据待测样品的限量要求、基质特性选择适宜方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0807铁盐检查法、通则0406原子吸收分光光度法GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27407-2010实验室质量控制规范食品毒理学检测中国食品药品检定研究院《药品检验操作规程》（2023年版）3方法原理3.1硫氰酸盐比色法铁盐在盐酸酸性介质中，三价铁离子与硫氰酸根离子发生配位反应，生成红色可溶性硫氰酸铁配位离子[Fe(SCN)₆]³⁻，反应式为：Fe³⁺+6SCN⁻→[Fe(SCN)₆]³⁻（红色）。反应体系中加入过硫酸铵作为氧化剂，可将供试品中可能存在的二价铁离子完全氧化为三价铁离子，同时抑制硫氰酸铁的还原褪色。将供试品与标准铁溶液同法处理后，通过目视比色或分光光度法测定吸光度，判定供试品中铁盐含量是否符合限量要求，或实现铁盐的半定量、定量测定。3.2原子吸收分光光度法铁元素的空心阴极灯可发射铁元素特征谱线（248.3nm），供试品经消解处理后，其中的铁元素完全转化为游离态三价铁离子，经原子化系统转化为铁基态原子，基态原子可吸收特征谱线，吸光度值与样品中铁元素浓度在一定范围内呈线性相关。通过测定供试品溶液的吸光度，与标准曲线比对即可定量计算供试品中铁元素含量，根据各品种限量要求判定是否符合规定。根据检出限需求可选择火焰原子化法（检出限0.05mg/L）或石墨炉原子化法（检出限0.001mg/L）。4试剂与材料4.1一般要求试验用水应符合GB/T6682-2008规定的一级水要求，所有试剂应为优级纯及以上级别，所有接触供试品、试剂的器皿均应为低铁玻璃、聚乙烯或铂金材质，使用前需经10%（v/v）硝酸溶液浸泡24h以上，再用一级水冲洗3次以上沥干备用，严禁使用铁质器具接触样品或试剂。4.2硫氰酸盐法所需试剂4.2.1标准铁贮备液：精密称取硫酸铁铵[FeNH₄(SO₄)₂·12H₂O，纯度≥99.9%]1.0000g，置1000ml量瓶中，加25%（v/v）硫酸溶液10ml溶解后，加一级水稀释至刻度，摇匀，4℃避光保存有效期为6个月。每1ml标准铁贮备液含100μgFe³+。4.2.2标准铁工作液：临用前精密量取标准铁贮备液10.0ml，置100ml量瓶中，加一级水稀释至刻度，摇匀，即得。每1ml标准铁工作液含10μgFe³+，临用现配。4.2.325%（v/v）硫酸溶液：量取25ml优级纯浓硫酸，缓缓加入75ml一级水中，边加边搅拌，放冷备用。4.2.4稀盐酸（1mol/L）：量取85ml优级纯浓盐酸，加一级水稀释至1000ml，摇匀备用。4.2.530%（g/ml）硫氰酸铵溶液：称取30g优级纯硫氰酸铵，加一级水溶解并稀释至100ml，避光保存有效期1个月。4.2.6过硫酸铵（固体，优级纯），临用前现称取。4.2.710%（g/ml）钨酸钠溶液：称取10g优级纯钨酸钠，加一级水溶解并稀释至100ml，摇匀备用。4.2.80.5mol/L硫酸溶液：量取28ml优级纯浓硫酸，缓缓加入适量一级水中，冷却后稀释至1000ml，摇匀备用。4.2.94%（g/ml）硼酸溶液：称取4g优级纯硼酸，加一级水溶解并稀释至100ml，摇匀备用（用于含氟供试品的掩蔽）。4.2.10正丁醇（优级纯），用于有色供试品的萃取除干扰。4.3原子吸收法所需试剂4.3.1硝酸（优级纯，金属杂质含量<0.00001%）4.3.2高氯酸（优级纯，金属杂质含量<0.00001%）4.3.330%（v/v）过氧化氢（优级纯，金属杂质含量<0.00001%）4.3.4混合消解酸：按硝酸:高氯酸=4:1的体积比混合均匀，临用前配制。4.3.50.5mol/L硝酸溶液：量取32ml优级纯硝酸，加一级水稀释至1000ml，摇匀备用。4.3.610%（g/ml）硝酸镁溶液：称取10g优级纯硝酸镁，加0.5mol/L硝酸溶液溶解并稀释至100ml，摇匀备用（干法消解助灰剂）。4.3.70.1%（g/ml）氯化钯溶液：称取0.1g优级纯氯化钯，加0.5mol/L硝酸溶液溶解并稀释至100ml，摇匀备用（石墨炉法基体改进剂）。4.3.8铁标准溶液：同4.2.1、4.2.2项下的标准铁贮备液、工作液，或采用经国家计量部门校准的铁元素标准溶液。4.4材料4.4.150ml纳氏比色管：同批次、同规格，管壁无划痕，透光率偏差≤2%，配套性符合要求。4.4.2A级容量瓶、A级移液管、聚四氟乙烯消解罐、瓷坩埚（50ml）、聚乙烯采样瓶等。5仪器与设备5.1通用设备电子分析天平（感量0.1mg，用于试剂配制、固体样品称量）、电子天平（感量0.01g，用于大量液体样品称量）、恒温水浴锅（控温精度±1℃）、高速离心机（最高转速≥5000rpm）、超纯水仪（出水电阻率≥18.2MΩ·cm）。5.2硫氰酸盐法专用设备紫外-可见分光光度计（波长范围190~900nm，波长精度±0.5nm），采用目视比色法时可无需配置。5.3原子吸收法专用设备原子吸收分光光度计（配置铁空心阴极灯、火焰/石墨炉原子化系统，配套数据处理软件）、电热消解仪（控温范围室温~300℃，控温精度±5℃）、微波消解仪（最高工作压力≥100bar，控温精度±2℃）、马弗炉（控温范围室温~1000℃，控温精度±20℃）。5.4仪器校准要求所有计量设备均需按国家计量检定规程要求定期校准，校准合格后方可使用。纳氏比色管使用前需开展配套性验证：各管加入等量一级水，目视观察无色差，480nm波长处测定透光率偏差≤2%即为合格。原子吸收分光光度计每年需开展性能检定，铜、铁等元素的检出限、精密度符合检定规程要求后方可使用。6测定方法6.1硫氰酸盐比色法本方法适用于铁盐限量≥2μg/50ml、基质无特殊干扰的供试品测定，是生物制品铁盐检查的常规首选方法。6.1.1供试品前处理根据供试品基质特性选择对应前处理方法：（1）澄清水溶性供试品：如疫苗稀释液、注射用重组蛋白原液、澄清的血液制品半成品等，无需特殊处理，直接按各品种规定的取样量量取供试品即可。（2）含蛋白质供试品：如人血白蛋白、重组单抗成品、细胞培养上清等，采用钨酸沉淀法除蛋白：取规定量供试品置50ml离心管中，加10%钨酸钠溶液2ml、0.5mol/L硫酸溶液2ml，充分振荡摇匀，室温静置10分钟使蛋白完全沉淀，3000rpm离心10分钟，取全部上清液转移至纳氏比色管中备用。（3）含铝佐剂供试品：如铝佐剂吸附的灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，采用酸解吸附法处理：取规定量供试品置离心管中，加1mol/L盐酸溶液5ml，充分振荡后60℃水浴加热10分钟，使铝佐剂完全溶解、吸附的铁离子完全释放，3000rpm离心10分钟，取全部上清液转移至纳氏比色管中备用。（4）含脂质/乳剂供试品：如脂质体疫苗、乳剂佐剂疫苗等，先加5ml无水乙醇破乳，振荡摇匀后按湿法消解（见6.2.1.1）处理后，待消解完全后再进行测定。（5）有色供试品：如本身带颜色的中药来源生物制品、偶联蛋白制品等，前处理方法同上述对应基质，后续测定时采用正丁醇萃取法消除颜色干扰。（6）含氟供试品：如含氟辅料的重组蛋白制品，前处理后加4%硼酸溶液5ml，充分摇匀后再进行后续测定，掩蔽氟离子干扰。6.1.2测定操作（1）供试品管制备：取上述处理好的供试品溶液置50ml纳氏比色管中，加1mol/L稀盐酸4ml、过硫酸铵50mg（若供试品含还原性成分，可增加至100mg），加一级水稀释至约35ml，摇匀后加30%硫氰酸铵溶液3ml，再加一级水稀释至刻度，充分摇匀，室温静置10分钟。若供试品本身有颜色，在稀释至刻度后加正丁醇20ml，剧烈振摇1分钟，静置分层后取上层正丁醇层进行比色。（2）标准对照管制备：根据各品种铁盐限量要求，精密量取对应体积的标准铁工作液（如规定每1g供试品铁盐不超过10μg，取1ml标准铁工作液；规定每剂供试品铁盐不超过5μg，取0.5ml标准铁工作液）置50ml纳氏比色管中，按与供试品管完全相同的步骤处理，制备得到标准对照管。（3）空白管制备：取与供试品前处理等量的试剂，按相同步骤处理，制备得到空白管，空白管红色应极浅或无色，否则说明试剂或器皿存在铁污染，需重新处理。6.1.3结果判定（1）目视比色法：供试品管的红色（或正丁醇层红色）深度浅于或等于标准对照管，判定为铁盐检查符合规定；深于标准对照管的，判定为不符合规定。（2）分光光度法：以空白管为参比，在480nm波长处分别测定供试品管、标准对照管的吸光度，供试品管吸光度≤标准对照管吸光度的，判定为符合规定；反之判定为不符合规定。如需定量，可配制系列浓度标准铁溶液，按相同步骤处理后测定吸光度，绘制标准曲线，计算供试品中铁盐含量。6.2原子吸收分光光度法本方法适用于铁盐限量<2μg/50ml、基质复杂硫氰酸盐法干扰较大的供试品测定，为铁盐定量测定的仲裁方法。6.2.1供试品前处理根据供试品基质特性选择适宜的消解方法，所有消解处理均需同步做试剂空白试验：（1）湿法消解：适用于大部分液体、半固体生物制品。取供试品0.5~2.0g（或液体供试品1~10ml，取样量根据铁盐预估含量调整）置100ml消解管中，加混合消解酸10ml，管口放置小漏斗，置电热消解仪上120℃加热1小时，待大量有机物分解后升温至180℃继续消解，直至溶液澄清无色，继续加热至近干（剩余残液约0.5ml），放冷至室温，加0.5mol/L硝酸溶液2ml溶解残渣，转移至25ml容量瓶中，加一级水稀释至刻度，摇匀备用。若消解后仍有浑浊，经0.45μm微孔滤膜过滤后取滤液测定。（2）微波消解：适用于易挥发、有机质含量高的供试品。取供试品0.2~1.0g置聚四氟乙烯消解罐中，加硝酸5ml、30%过氧化氢2ml，密封后按以下程序消解：120℃保持5min，150℃保持5min，180℃保持20min。消解完成后自然冷却至室温，开罐将消解液转移至25ml容量瓶中，加一级水稀释至刻度，摇匀备用。（3）干法消解：适用于不易挥发、含磷量低的供试品。取供试品1.0~5.0g置50ml瓷坩埚中，小火加热至完全炭化（无烟产生），转移至马弗炉中550℃灰化4小时，放冷后取出，加1mol/L硝酸溶液5ml溶解灰分，转移至25ml容量瓶中定容。含磷量高的供试品干法消解时，需在炭化前加10%硝酸镁溶液1ml作为助灰剂，避免铁生成难溶磷酸盐导致结果偏低。6.2.2测定操作（1）仪器参数设置：铁元素特征谱线为248.3nm，狭缝宽度0.2nm，灯电流5mA。火焰法采用乙炔-空气火焰，乙炔流量2.0L/min，空气流量15.0L/min，燃烧头高度6mm；石墨炉法采用程序升温：干燥120℃保持20s，灰化1000℃保持15s，原子化2400℃保持5s，净化2600℃保持3s，石墨炉测定时每1ml供试品溶液加0.1ml0.1%氯化钯溶液作为基体改进剂。（2）标准曲线制备：火焰法取标准铁工作液配制浓度为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg/L的系列标准溶液；石墨炉法取标准铁工作液配制浓度为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1mg/L的系列标准溶液，按上述仪器参数测定各浓度的吸光度，以吸光度为纵坐标、铁浓度为横坐标绘制标准曲线，标准曲线的线性相关系数应≥0.999方可使用。（3）供试品测定：取处理好的供试品溶液、试剂空白溶液，按与标准溶液完全相同的条件测定吸光度，若供试品溶液吸光度超出标准曲线线性范围，需稀释后重新测定。6.2.3结果计算供试品中铁盐含量按式（1）计算：X=(C₁-C₀)×V×f/m（1）式中：X——供试品中铁盐含量，单位为μg/g（或μg/ml）；C₁——供试品溶液中铁浓度，单位为μg/ml；C₀——试剂空白溶液中铁浓度，单位为μg/ml；V——供试品消解后定容体积，单位为ml；f——供试品溶液稀释倍数（未稀释时f=1）；m——供试品取样量，单位为g（或ml）。计算结果保留两位有效数字，低于定量限时以“<定量限值”表示。6.2.4结果判定计算得到的供试品铁盐含量不超过各品种规定的限量值时，判定为符合规定；超过限量值时判定为不符合规定。基质复杂的供试品可采用标准加入法进行定量，结果更准确。7方法学验证要求本方法用于新生物制品的质量标准建立时，需开展以下方法学验证，验证参数符合要求后方可纳入质量标准：7.1专属性取不含铁的空白基质（与供试品配方一致的辅料混合物），按规定方法处理后测定，空白响应值（吸光度或原子吸收响应）不得超过标准对照品响应值的10%，证明基质无明显干扰。7.2准确度采用加标回收试验验证，分别在空白基质中加入低、中、高三个浓度的铁标准溶液（低浓度为限量值的50%、中浓度为限量值、高浓度为限量值的150%），每个浓度平行制备3份，按规定方法测定，计算回收率。回收率应在80%~120%范围内，相对标准偏差（RSD）≤10%。7.3精密度7.3.1重复性：同一操作人员在同一试验条件下，平行测定6份同一份供试品，测定结果的RSD≤10%。7.3.2中间精密度：由2名不同操作人员，在不同日期、不同仪器上分别测定同一份供试品各6份，12份测定结果的RSD≤15%。7.4检出限与定量限检出限为3倍空白响应值的标准偏差对应的铁浓度，定量限为10倍空白响应值的标准偏差对应的铁浓度。要求定量限不得超过各品种规定限量值的1/3，确保测定结果的准确性。硫氰酸盐法典型检出限为1μg/50ml，定量限为2μg/50ml；火焰原子吸收法典型检出限为0.05mg/L，定量限为0.2mg/L；石墨炉原子吸收法典型检出限为0.001mg/L，定量限为0.005mg/L。7.5线性定量测定用的标准曲线线性相关系数应≥0.995（硫氰酸盐分光光度法）或≥0.999（原子吸收法）。8质量控制要求8.1每批次试验需同步开展平行样测定，平行样的相对偏差不得超过15%，否则需重新测定。8.2每20份供试品（或每批次试验，不足20份时按批次计）需同步测定试剂空白，空白中铁含量不得超过定量限，否则说明存在器皿或试剂污染，需更换试剂、重新处理器皿后再开展试验。8.3每批次试验需同步开展阳性加标对照试验，加标回收率应在80%~120%范围内，否则说明试验过程存在系统误差，需排查原因后重新测定。8.4标准铁贮备液4℃避光保存有效期6个月，超过有效期需重新配制、标定；标准铁工作液临用前现配，不得放置超过24小时。硫氰酸铵溶液避光保存有效期1个月，过硫酸铵需临用前称量加入。8.5实验室需建立铁盐测定的内部质量控制体系，每6个月开展一次内部比对试验，或参加国家组织的能力验证试验，结果满意方可继续开展检测工作。9注意事项9.1样品采集与保存：供试品采样容器需采用聚乙烯材质，经10%硝酸浸泡处理后方可使用，采样过程中严禁接触铁质器具，避免外源铁污染。供试品需按各品种规定的条件保存，避免样品变质导致铁离子的溶出或沉淀，影响测定结果。9.2硫氰酸盐法操作注意事项：（1）反应体系盐酸浓度需控制在0.1~0.5mol/L范围内，浓度过低易导致铁离子水解，浓度过高会导致硫氰酸根与氢离子结合生成弱电解质HSCN，降低配位离子浓度，使颜色变浅，影响测定灵敏度；（2）过硫酸铵需保证足量，确保所有二价铁离子完全氧化为三价铁离子，若供试品含维生素C、亚硫酸钠等还原性成分，需适当增加过硫酸铵用量至100~200mg；（3）硫氰酸铵需过量加入，确保配位反应完全，提高反应稳定性，降