生物制品铜盐测定指南（试行）

生物制品铜盐测定指南（试行）1范围本指南适用于疫苗类（灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、多糖疫苗、结合疫苗等）、血液制品类（人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、凝血因子类制品等）、重组治疗性生物制品类（重组单克隆抗体、重组细胞因子、重组融合蛋白等）、抗血清及抗毒素类制品的原液、半成品、成品中铜盐残留量的测定。本指南不适用于主动添加铜盐作为活性成分、佐剂或稳定剂的生物制品检测。各实验室可根据样品基质特性、铜盐限值要求及实验室设备配置，选择合适的检测方法，其中二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法适用于快速筛查，火焰原子吸收分光光度法适用于铜含量≥0.3μg/g的样品定量，石墨炉原子吸收分光光度法适用于铜含量0.01μg/g~0.3μg/g的样品定量，电感耦合等离子体质谱法适用于铜含量<0.01μg/g的超低含量样品定量。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部生物制品国家质量标准GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T15337-2008原子吸收光谱分析法通则GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南JJG694-2009原子吸收分光光度计检定规程JJG1158-2018电感耦合等离子体质谱仪检定规程3术语和定义3.1铜盐残留：指生物制品生产过程中，由原辅材料、生产设备（不锈钢管路、储罐、层析填料等）、包材引入的游离态或结合态铜离子的总残留量，以铜元素计。3.2基质效应：样品中除目标物外的其他基质成分对目标物测定信号的增强或抑制作用。3.3检出限（LOD）：在给定的置信水平下，能够定性检出样品中目标物的最低浓度，本指南中以11次试剂空白测定值的标准偏差的3倍对应浓度计算。3.4定量限（LOQ）：在给定的置信水平下，能够准确定量样品中目标物的最低浓度，其测定结果的精密度和准确度需满足方法要求，本指南中以11次试剂空白测定值的标准偏差的10倍对应浓度计算。3.5平行样：同一批次样品中同时取出两份及以上相同量的子样，在完全相同的试验条件下同步处理、测定，用于验证检测结果的重复性。4试验原理4.1二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法样品经消解破坏有机基质后，铜离子在pH9.0~9.2的氨性条件下，与二乙基二硫代氨基甲酸钠（铜试剂）反应生成黄棕色胶体络合物，经四氯化碳萃取后，有机相颜色深度与铜离子浓度成正比，与标准系列目视比色或分光光度比色即可定量。4.2火焰原子吸收分光光度法（FAAS）样品经消解后导入原子化器，铜离子在空气-乙炔火焰中原子化形成基态铜原子，对铜空心阴极灯发射的324.7nm特征共振线产生选择性吸收，在一定浓度范围内，吸光度与铜离子浓度成正比，与标准曲线比较定量。4.3石墨炉原子吸收分光光度法（GFAAS）样品经消解后注入热解涂层石墨管，经干燥、灰化、原子化程序使铜离子原子化，基态铜原子吸收324.7nm特征共振线，吸光度与铜离子浓度成正比，相比火焰法灵敏度提高1~2个数量级，适用于低含量铜的测定。4.4电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）样品经消解后经载气引入氩等离子体中，铜元素被电离为带正电的铜离子（⁶³Cu、⁶⁵Cu），经质量分析器按质荷比分离后，检测器测定铜离子的计数强度，在一定浓度范围内，计数强度与铜离子浓度成正比，可实现超低含量铜的准确定量。5试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为优级纯及以上纯度，试验用水符合GB/T6682-2008规定的一级水（电阻率≥18.2MΩ·cm）。5.1硝酸：MOS级或电子级，ρ≈1.42g/mL，需经亚沸蒸馏提纯后使用，或直接使用市售超低金属元素级硝酸。5.2盐酸：MOS级，ρ≈1.19g/mL。5.330%过氧化氢：优级纯，无金属杂质。5.4四氯化碳：优级纯，若含杂质需重蒸后使用。5.5氨水：优级纯，ρ≈0.91g/mL，1+1（v/v）溶液，临用现配。5.6柠檬酸铵-乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）掩蔽液：称取20.0g柠檬酸铵、5.0gEDTA-2Na，溶于100mL一级水中，摇匀备用。5.70.1%（m/v）铜试剂溶液：称取0.1g二乙基二硫代氨基甲酸钠，溶于100mL一级水中，过滤后避光保存，临用现配。5.8基体改进剂（石墨炉法用）：0.1%（m/v）磷酸二氢铵溶液，用1%硝酸配制，优级纯磷酸二氢铵。5.9内标溶液（ICP-MS用）：10μg/mL钪（Sc）标准储备液，使用时用1%硝酸稀释为10ng/mL的内标工作液，在线加入。5.10铜标准储备液：1000μg/mL铜元素有证标准物质，或自行配制：准确称取1.0000g高纯铜粉（纯度≥99.999%），置于100mL烧杯中，加入10mL1+1硝酸，低温加热至完全溶解，赶尽氮氧化物，冷却后转移至1000mL容量瓶，用1%硝酸定容至刻度，摇匀，4℃避光保存，有效期1年。5.11铜标准工作液：根据不同检测方法的要求，用铜标准储备液逐级稀释至所需浓度，临用现配：（1）比色法用：10μg/mL，用1%硝酸稀释。（2）火焰原子吸收法用：100μg/mL，用1%硝酸稀释。（3）石墨炉原子吸收法用：1μg/mL，用1%硝酸稀释。（4）ICP-MS用：100ng/mL，用1%硝酸稀释。5.12质控样品：铜元素含量已知的生物基质有证标准物质，或实验室自制的铜加标质控样品，浓度覆盖样品的预期含量范围。5.13微孔滤膜：0.45μm水相聚丙烯滤膜，经20%硝酸浸泡24h后，用一级水冲洗干净备用。6仪器与设备6.1通用设备6.1.1电子分析天平：感量0.1mg，经计量检定合格。6.1.2微波消解仪：带温度、压力控制系统，温控精度±5℃，消解罐为聚四氟乙烯材质，经酸泡处理。6.1.3温控电热板：温控范围室温~250℃，精度±5℃，面板为聚四氟乙烯涂层，避免金属污染。6.1.4马弗炉：最高温度≥1000℃，温控精度±10℃。6.1.5pH计：精度±0.01，经计量检定合格。6.1.6样品容器：聚丙烯或聚四氟乙烯材质的离心管、容量瓶、比色管，使用前经20%硝酸浸泡24h以上，一级水冲洗3次，晾干备用，禁止使用普通玻璃容器。6.2各方法专用设备6.2.1比色法：50mL同批次纳氏比色管，125mL聚四氟乙烯活塞分液漏斗，紫外-可见分光光度计，1cm石英比色皿。6.2.2原子吸收分光光度计：经计量检定合格，带铜空心阴极灯，氘灯或塞曼效应背景校正装置，石墨炉法需配置热解涂层石墨管。6.2.3电感耦合等离子体质谱仪：经计量检定合格，带碰撞反应池，可消除多原子离子干扰。7样品采集与保存7.1采样容器：采用聚丙烯或聚四氟乙烯材质的容器，禁止使用玻璃或金属容器，避免引入铜污染。7.2取样量：根据样品中铜的预期含量确定，含量≥1μg/g的样品取样量为0.2~1.0g（或mL，精确至0.0001g），含量<1μg/g的样品取样量为1.0~5.0g（或mL），平行样取样量一致。7.3样品处理：冻干制品按说明书规定的复溶体积用一级水复溶，完全溶解后混匀取样；含佐剂的样品需涡旋振荡5min，保证佐剂分散均匀后取样；含高浓度甘油的样品需室温平衡后充分混匀取样。7.4样品保存：样品采集后若不能立即检测，需密封后按产品说明书规定的储存条件保存，含蛋白的样品避免反复冻融，防止蛋白沉淀导致铜分布不均，保存时间不超过7天。8样品前处理所有前处理过程需同步做2份试剂空白，空白试验除不加样品外，其余操作与样品完全一致。8.1湿式消解法（适用于蛋白含量低、基质简单的样品，如多糖疫苗、缓冲液类制品）准确称取样品于50mL聚四氟乙烯消化管中，加入10mL硝酸，加盖浸泡过夜，次日加入2mL30%过氧化氢，置于温控电热板上，120℃加热2h至大部分有机物分解，升温至160℃继续消解至溶液澄清透明，赶酸至剩余体积约0.5~1.0mL，冷却至室温，用1%硝酸转移至25mL容量瓶中定容，摇匀备用。若溶液有不溶残渣，经0.45μm滤膜过滤后待测。8.2微波消解法（适用于蛋白含量高、基质复杂的样品，如血液制品、重组单克隆抗体、mRNA疫苗等）准确称取样品于微波消解罐中，加入5mL硝酸、2mL30%过氧化氢，密封消解罐，按表1程序进行消解：表1微波消解参考程序步骤升温时间（min）目标温度（℃）保持时间（min）15120523150535180158.3干灰化法（适用于含铝佐剂、无机盐含量高的样品，如吸附类疫苗、缓释制剂等）准确称取样品于瓷坩埚中，置于电热板上小火碳化至无烟产生，移入马弗炉中550℃灰化4h，冷却至室温，若灰分呈黑色，加入1mL硝酸润湿后重新灰化2h至灰分呈白色或浅灰色。取出坩埚冷却后加入2mL1+1硝酸溶解灰分，转移至电热板上赶酸至近干，用1%硝酸溶解后转移至25mL容量瓶定容，摇匀备用。9测定步骤9.1第一法二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法（筛查法，LOD=0.5μg/g，LOQ=1.0μg/g）9.1.1标准系列配制：取6支50mL纳氏比色管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL10μg/mL铜标准工作液，对应铜含量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg，加入1%硝酸至总体积20mL。9.1.2样品管制备：分别取10mL样品消解液、试剂空白消解液置于50mL纳氏比色管中，加入1%硝酸至总体积20mL。9.1.3显色与测定：向各管加入5mL柠檬酸铵-EDTA-2Na掩蔽液，摇匀，用1+1氨水调节pH至9.0~9.2（可滴加1滴酚酞指示剂，溶液呈微红色即可），加入1mL0.1%铜试剂溶液，摇匀后准确加入10.0mL四氯化碳，剧烈振摇2min，静置分层。9.1.4结果判定：目视比色时，若样品管四氯化碳层颜色浅于或等于限值对应的标准管颜色，判为符合限值要求；若深于标准管颜色，判为不符合限值要求，需采用定量方法复核。分光光度定量时，将四氯化碳层移入1cm石英比色皿，以零浓度管为参比，在440nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，样品浓度代入曲线计算铜含量。9.1.5注意事项：①铁、锰、钴等重金属离子可与铜试剂反应显色，若样品中上述离子含量≥100μg，需额外加入2mL掩蔽液消除干扰；②铜-铜试剂络合物对光敏感，显色后需在30min内完成测定，避免阳光直射；③若样品消解液本身有颜色，需制备样品空白（除不加铜试剂外，其余操作与样品管一致），扣除背景吸光度。9.2第二法火焰原子吸收分光光度法（定量法，LOD=0.1μg/g，LOQ=0.3μg/g）9.2.1仪器条件优化：灯电流3~5mA，分析波长324.7nm，狭缝宽度0.5nm，空气流量5.0L/min，乙炔流量1.0L/min，燃烧器高度6mm，开启氘灯背景校正，点燃火焰预热30min至仪器稳定。9.2.2标准曲线绘制：取100μg/mL铜标准工作液，用1%硝酸稀释为0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0μg/mL的标准系列，按优化后的仪器条件依次测定吸光度，以铜浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.999。9.2.3样品测定：依次测定试剂空白、样品消解液的吸光度，若样品吸光度超过标准曲线最高点，用1%硝酸稀释后重新测定，记录稀释倍数。9.2.4结果计算：铜含量X（μg/g或μg/mL）按公式（1）计算：X=(c-c₀)×V×F/m（1）式中：c——样品消解液中铜的浓度，单位为μg/mL；c₀——试剂空白中铜的浓度，单位为μg/mL；V——消解液定容体积，单位为mL；F——样品稀释倍数；m——样品取样量，单位为g或mL。9.2.5注意事项：①每次进样后用1%硝酸冲洗进样系统30s，避免交叉污染；②雾化器需定期清理，避免盐分或蛋白残留堵塞，降低雾化效率；③若样品基质含盐量≥1%，需采用标准加入法消除基质效应。9.3第三法石墨炉原子吸收分光光度法（定量法，LOD=0.005μg/g，LOQ=0.01μg/g）9.3.1仪器条件优化：灯电流3mA，分析波长324.7nm，狭缝宽度0.5nm，开启塞曼背景校正，石墨炉升温程序参考表2，进样量20μL，基体改进剂进样量5μL。表2石墨炉升温参考程序步骤温度（℃）升温时间（s）保持时间（s）氩气流量（mL/min）干燥1001010200干燥140510200灰化12001015200原子化2300030净化2500122009.3.3样品测定：依次测定试剂空白、样品消解液的吸光度，基质复杂的样品采用标准加入法测定：取4份等体积样品消解液，分别加入0、0.01、0.02、0.05μg/mL的铜标准，用1%硝酸定容至相同体积，测定吸光度后外推得到样品中铜的浓度。9.3.4结果计算：同9.2.4。9.3.5注意事项：①石墨管需定期更换，更换后需重新优化升温程序并绘制标准曲线；②灰化温度需根据基质特性优化，既保证基质充分灰化降低背景，又避免铜的挥发损失。9.4第四法电感耦合等离子体质谱法（定量法，LOD=0.0001μg/g，LOQ=0.0003μg/g）9.4.1仪器调谐：开机后用调谐液优化仪器参数，要求射频功率1550W，等离子体气流量15L/min，辅助气流量1.0L/min，载气流量0.8L/min，氦碰撞气流量4.5mL/min，氧化物产率（CeO/Ce）≤3%，双电荷产率（Ce²⁺/Ce）≤2%，质量轴偏差≤0.05u。9.4.2标准曲线绘制：取100ng/mL铜标准工作液，用1%硝酸稀释为0、0.01、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0ng/mL的标准系列，在线加入10ng/mL钪内标，测定⁶³Cu与⁴⁵Sc的计数比，以铜浓度为横坐标，计数比为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.999。9.4.3样品测定：依次测定试剂空白、样品消解液的计数比，若基质效应明显，采用基质匹配标准曲线或标准加入法定量。9.4.4结果计算：同9.2.4。9.4.5注意事项：①每测定10个样品需插入一个质控样，验证仪器稳定性；②避免环境灰尘引入污染，进样过程需加盖密封，所有耗材需经过严格酸泡处理。10方法学验证要求新方法投入使用前或实验室首次开展铜盐测定时，需按GB/T27417-2017要求进行方法学验证，验证指标及合格标准如下：10.1准确度：采用加标回收试验验证，分别在定量限、2倍限值、10倍限值3个浓度水平加标，每个水平做6份平行样，回收率要求在80%~110%范围内，相对标准偏差（RSD）≤10%。10.2精密度：①重复性：同一检测人员、同一仪器、同一时间测定6份平行样，RSD≤10%；②中间精密度：不同检测人员、不同时间、不同仪器测定6份平行样，RSD≤15%。10.3专属性：试剂空白的响应值不得超过定量限响应值的10%，基质中其他共存成分对铜测定的干扰率≤10%。10.4线性与范围：标准曲线相关系数需满足各方法要求，线性范围覆盖从定量限到10倍限值浓度。10.5检出限与定量限：按11次空白测定的3倍、10倍标准偏差计算，要求检出限≤限值的1/10，定量限≤限值的1/5。10.6耐用性：考察pH±0.5、消解温度±10℃、仪器参数微小波动对测定结果的影响，RSD≤10%。11检测质量控制每批次检测需同步开展以下质量控制，否则检测结果无效：11.1试剂空白：每批次至少做2份试剂空白，空白中铜的含量不得超过样品中铜含量的5%，若超出则需排查试剂、容器污染，重新试验。11.2质控样品：每批次至少带1份有证标准物质或已知浓度的质控样，