生物制品无菌保障技术指南（试行）

生物制品无菌保障技术指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、血液制品、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、基因治疗产品、细胞治疗产品、多肽类生物制品、医用生物活性敷料等所有上市及在研无菌生物制品的研发、中试、商业化生产、放行、上市后全链条无菌保障管控，同时适用于生物制品生产用原辅材料、直接接触产品的包装材料、生产设备、工艺辅助系统的无菌性能验证与日常管控。非无菌生物制品的微生物限度管控可参照本指南相关要求执行。2规范性引用文件本指南内容符合现行有效法规、标准与技术规范要求，主要引用文件包括：《中华人民共和国药典》2025年版三部、四部；GB50457-2019《医药工业洁净厂房设计标准》；GB/T20204-2006《医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法》；GB/T20205-2006《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》；GB/T20207-2006《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》；ICHQ7《原料药生产质量管理规范指南》；ICHQ9《质量风险管理指南》；ICHQ10《药品质量体系指南》；PDATR70《无菌生产工艺验证》；PDATR22《除菌过滤工艺验证》。3术语与定义3.1无菌保障水平（SAL）：指产品经灭菌或除菌处理后，单位产品中存在活微生物的概率，所有无菌生物制品的最终SAL需≤1×10^-6，即每百万单位产品中污染活微生物的产品数量不超过1个。3.2污染控制策略（CCS）：基于产品特性、工艺风险、污染来源的全面识别，制定的涵盖人员、环境、设备、物料、工艺、检验全维度的污染预防、控制、监测、纠正的系统性管控方案，是无菌保障体系的核心框架。3.3除菌级滤器：指额定孔径不超过0.22μm（或标称0.2μm），对缺陷假单胞菌（Brevundimonasdiminuta，ATCC19146）的截留效率≥1×10^7CFU/cm²有效过滤面积的微孔滤膜滤器；针对粒径小于200nm的生物活性组分（如AAV病毒载体、多肽类分子），可采用额定孔径0.1μm的除菌级滤器，截留效率要求不变。3.4湿热灭菌F0值：指在121℃饱和蒸汽条件下的等效灭菌时间，F0≥12min为过度杀灭法，F0≥8min且<12min为残存概率法。3.5包装密封完整性（CCIT）：指无菌产品包装防止微生物侵入、保持内部无菌环境的性能，最大允许泄漏孔径≤0.2μm，泄漏率≤1×10^-6mbar·L/s。4无菌保障体系核心原则4.1风险分级管控原则根据产品特性、给药途径、工艺可灭菌性划分管控等级：高风险等级：无法采用终端灭菌工艺的产品（细胞治疗产品、基因治疗产品、大部分重组蛋白液体制剂、血液制品凝血因子类产品等）、给药途径为静脉/鞘内/眼内/颅内的产品、适用人群为新生儿/免疫缺陷人群的产品，要求污染控制措施冗余度≥3层，所有关键风险点需设置双重监测机制。中风险等级：可采用残存概率法终端灭菌的产品、皮下/肌内给药的非最终灭菌冻干制剂，要求污染控制措施冗余度≥2层，关键风险点至少设置1项在线监测机制。低风险等级：可采用过度杀灭法终端灭菌的产品，要求污染控制措施冗余度≥1层，重点管控灭菌工艺的稳定性。4.2全生命周期覆盖原则无菌保障需贯穿产品研发、生产、放行、上市后全生命周期，优先通过工艺设计降低污染风险，避免依赖最终检验控制无菌水平。所有无菌保障相关的管控措施、验证数据、监测记录需可追溯，保存期限不短于产品有效期后5年，且不少于10年。5研发阶段无菌保障设计5.1工艺选型优先顺序无菌工艺选型需遵循“可灭菌不除菌、可终端不无菌生产”的原则，优先顺序为：过度杀灭法终端湿热灭菌>残存概率法终端湿热灭菌>γ辐射灭菌>除菌过滤+A级区灌装>无除菌过滤步骤的A级区无菌生产。对无法采用终端灭菌工艺的产品，需提供充分的验证数据证明终端灭菌后产品活性保留率<90%、或关键质量属性（纯度、活性、杂质水平）不符合注册标准，不得无故选用非最终灭菌工艺。5.2污染控制策略（CCS）开发采用失效模式与影响分析（FMEA）工具开展全流程污染风险识别，风险识别需覆盖：人员操作风险（更衣合规性、操作动作、人员数量）、环境风险（洁净级别、气流组织、监测频率）、物料风险（初始微生物负载、包装密封性、灭菌效果）、设备风险（接触产品部件的清洁灭菌效果、密封完整性、冷凝水排放）、工艺风险（开放操作时长、物料转移路径、工艺温度、批次规模）。每个识别出的中高等级风险（风险优先数RPN≥100）需对应至少1项预防措施、1项监测措施、1项纠正措施，CCS文件需明确所有管控措施的执行标准、监测频率、超标处置流程。5.3关键工艺验证设计5.3.1终端灭菌工艺验证过度杀灭法湿热灭菌验证要求：连续开展3次满载运行，确认灭菌柜冷点F0值≥12min，温度偏差≤±1℃；微生物挑战试验采用嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus，ATCC7953）孢子，载体放置于冷点及其他高风险点位，孢子负载量≥1×10^6CFU/载体，挑战后所有载体无菌生长，判定验证合格。残存概率法湿热灭菌验证要求：连续开展3次满载运行，冷点F0值≥8min；微生物挑战试验采用的孢子负载量需≥产品实际生物负载的1000倍，挑战后计算SAL≤1×10^-6，判定验证合格。对不耐受121℃的产品，可采用115℃、30min的灭菌参数，需验证F0值满足要求。γ辐射灭菌验证要求：辐照剂量设定为25~35kGy，微生物挑战采用短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus，ATCC27142）孢子，负载量≥1×10^6CFU/载体，辐照后所有载体无菌生长，同时验证辐照后产品活性、纯度、降解产物符合质量标准，判定验证合格。5.3.2除菌过滤工艺验证需开展的验证项目包括：滤膜相容性试验（滤膜与产品接触后，浸出物符合安全性标准，产品活性、纯度回收率≥95%）、完整性测试方法验证（明确起泡点、扩散流、压力保持法的阈值，偏差≤±5%）、细菌截留试验（采用缺陷假单胞菌ATCC19146，挑战浓度≥1×10^7CFU/cm²有效过滤面积，过滤后滤液无菌，连续3次试验合格）。除菌滤器的最长使用时限、最大过滤压差、最大过滤体积需经过验证，同一滤器不得用于多批次产品过滤，除非有充分的验证数据证明交叉污染风险可控、截留效率未下降。两级除菌级滤器串联工艺可作为高风险产品的冗余除菌措施，两级滤器的完整性测试均需合格方可放行产品。5.3.3无菌灌装工艺验证（培养基模拟灌装）首次验证需连续开展3批，需覆盖最差条件：最大生产批量、最长操作时间、最多操作人员、工艺所有干预步骤（设备调整、物料补充、取样、清场）、更衣时段高风险节点。批量要求：高风险产品每批灌装量≥最大批量的10%，且不少于3000个灌装单元；中风险产品每批不少于2000个灌装单元；低风险非最终灭菌产品每批不少于1000个灌装单元；批量小于1000个单元的细胞治疗产品，模拟灌装批量需与实际生产批量一致。合格标准：灌装后采用胰酪大豆胨培养基（TSB）在30~35℃条件下培养14天，沙氏葡萄糖培养基（SDA）在20~25℃条件下培养14天，阳性对照污染率100%，阴性对照无菌，污染率≤0.1%判定为合格。培养基模拟灌装每年至少开展2次再验证，发生重大变更（洁净区改造、工艺路线调整、核心操作人员变更比例≥30%）时需重新开展验证。6生产阶段无菌保障管控6.1洁净区环境管控洁净区级别与监测指标需符合以下要求：A级区（高风险操作区，含灌装区、无菌连接区、敞口产品暴露区）：静态、动态悬浮粒子≥0.5μm≤3520个/m³、≥5μm≤20个/m³；浮游菌≤1CFU/m³；沉降菌（φ90mm培养皿暴露30min）≤1CFU/皿；表面微生物（接触碟φ55mm）≤1CFU/碟；操作人员手套表面微生物≤1CFU/只。B级区（A级区背景区）：静态悬浮粒子≥0.5μm≤352000个/m³、≥5μm≤2900个/m³；动态悬浮粒子≥0.5μm≤3520000个/m³、≥5μm≤29000个/m³；浮游菌≤10CFU/m³；沉降菌（φ90mm培养皿暴露4h）≤5CFU/皿；表面微生物≤5CFU/碟。C级区：静态悬浮粒子≥0.5μm≤3520000个/m³、≥5μm≤29000个/m³；动态悬浮粒子≥0.5μm≤35200000个/m³、≥5μm≤290000个/m³；浮游菌≤100CFU/m³；沉降菌≤50CFU/4h。D级区：静态悬浮粒子≥0.5μm≤35200000个/m³、≥5μm≤290000个/m³；浮游菌≤200CFU/m³；沉降菌≤100CFU/4h。监测频率要求：A级区悬浮粒子、浮游菌连续在线监测，沉降菌、表面微生物每生产批次监测；B级区悬浮粒子每2小时监测1次，浮游菌每日监测，沉降菌、表面微生物每周监测2次；C级区悬浮粒子每周监测1次，微生物每月监测1次；D级区每季度监测1次。环境监测超标（OOS/OOT）需在24小时内启动调查，识别污染来源，落实纠正预防措施（CAPA），对涉及批次产品开展风险评估，确认无质量风险后方可进入下一工序，必要时启动产品报废程序。6.2人员管控进入B/A级洁净区的人员需接受不少于20学时的无菌操作、更衣程序专项培训，连续3次更衣后表面微生物采样合格（手套、袖口、面罩表面微生物≤1CFU/碟）方可上岗，每年至少开展1次再培训考核，考核不合格人员不得进入洁净区。A级区同时作业人员不得超过5人，除非有验证数据证明更多人员的污染风险可控；洁净区内操作需遵循动作幅度小、移动速度慢、避免跨越无菌区、避免面向产品讲话的原则，所有干预操作需提前记录在批记录中，非常规干预需经质量部门批准后方可实施。6.3物料管控生产用原辅材料初始微生物负载需符合内控标准：细胞培养用培养基微生物负载≤10CFU/ml，蛋白纯化用缓冲液微生物负载≤100CFU/ml、内毒素≤0.25EU/ml，药用辅料微生物负载≤100CFU/g。直接接触产品的包材、器具灭菌后SAL≤1×10^-6，每批次灭菌后抽样开展包装密封完整性测试，合格方可入库。物料进入B/A级区需经过消毒处理：外包装采用75%乙醇擦拭+汽化过氧化氢（VHP）消毒，VHP浓度≥6mg/L、相对湿度40%~60%、消毒时间≥15min；内包材、工器具需经过湿热灭菌或辐射灭菌，通过无菌传递舱进入洁净区。6.4设备与工艺辅助系统管控直接接触产品的设备部件清洁验证要求：微生物残留≤1CFU/100cm²，内毒素残留≤0.125EU/100cm²，产品残留≤10ppm。在线灭菌（SIP）系统验证要求：冷点F0值≥12min，冷凝水排净，连续3次验证合格方可使用，每批次生产前开展SIP并同步进行密封完整性测试。工艺辅助系统监测要求：注射用水微生物负载≤10CFU/100ml、内毒素≤0.25EU/ml、总有机碳≤500ppb，每日取样监测；纯化水微生物≤100CFU/ml，每周监测；工艺用气（压缩空气、氮气）微生物≤1CFU/m³、油份≤0.1mg/m³、露点≤-40℃，每月监测。6.5生产过程管控A级区所有敞口操作需在层流罩保护下进行，开放操作时长不得超过验证的最长时限（常规不得超过4h），尽量采用密闭管路转移物料，减少开放操作频次。每批次生产过程中需对操作人员手套、A级区设备表面、关键操作点位进行微生物采样，采样结果纳入批记录审核范畴。所有无菌产品需逐件或按批次抽样开展包装密封完整性测试，测试方法可采用真空衰减法、高压放电法、微生物挑战法，确保产品有效期内无菌性能稳定。7放行阶段无菌保障管控7.1无菌检验要求按照《中华人民共和国药典》2025年版四部无菌检查法开展检验，检验量不得少于20个产品单元，或不少于批量的10%，最少不得少于10个单元；批量小于100个单元的细胞治疗产品，检验量不得少于2个单元，同时采用经过验证的快速微生物检测方法（ATP生物发光法、荧光PCR法、固相细胞计数法）作为补充，快速方法检测限≤10CFU/样品、假阴性率≤0.1%、假阳性率≤0.1%。检验周期为14天，阴性对照需无菌生长，阳性对照需100%出现微生物生长，检验结果合格方可进入放行审核流程。7.2放行审核要求产品放行前需审核以下无菌保障相关资料：环境监测全部符合标准、人员微生物监测数据合格、设备灭菌记录与完整性测试报告合格、原辅材料/包材无菌检验报告合格、除菌滤器完整性测试合格、无菌检验结果合格、所有工艺偏差已调查关闭并确认无质量风险。所有资料符合要求后方可放行，任何一项存在疑问的需开展补充风险评估，必要时不予放行。8偏差与变更管控8.1无菌相关偏差分级处置严重偏差：无菌检验阳性、培养基模拟灌装污染率>0.1%、A级区微生物连续3次超标、灭菌工艺生物指示剂阳性。发生严重偏差时，涉及批次产品不得放行，已上市产品立即启动召回，24h内上报属地药品监管部门，开展全链条根源调查，落实CAPA，整改完成经监管部门核查合格后方可恢复生产。一般偏差：单点位环境微生物超标、人员手套采样超标、滤器完整性初始不合格重试合格、次要工艺干预未记录。发生一般偏差时需在7个工作日内完成根源调查，落实CAPA，对涉及批次产品开展风险评估，确认无无菌污染风险后方可放行。8.2无菌相关变更管控所有涉及无菌保障的变更（工艺路线调整、灭菌工艺变更、除菌滤器供应商变更、洁净区改造、生产场地变更）均需开展全面风险评估，开展相应的验证工作，按照法规要求报监管部门批准或备案后方可实施，变更实施后连续3批产品开展全项无菌保障监测，确认变更未引入无菌风险后方可常规生产。9