生物制品细菌检查指南（试行）

生物制品细菌检查指南（试行）1适用范围本指南适用于各类预防用、治疗用、诊断用生物制品的细菌质量控制检查，覆盖灭活疫苗、减毒活疫苗、抗毒素/抗血清、血液制品、重组蛋白制品、基因治疗产品、细胞治疗产品、体外诊断用生物制品的原液、中间品、成品检验，同时涵盖生产用原料、辅料、生产环境接触面、工艺用气、工艺用水的细菌监控。本指南所指细菌检查包含需氧菌总数计数、厌氧菌总数计数、规定致病菌检测，不适用于支原体、真菌、分枝杆菌、病毒类微生物的专项检测，相关检测另行执行对应规范。对于有特殊监管要求的生物制品（如CAR-T细胞产品、天花疫苗等），应在符合本指南要求的基础上，额外执行国家药监部门发布的专项质量控制标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。包括：《中华人民共和国药典》2025年版三部、《药品生产质量管理规范（2010年修订）》生物制品附录、WHO《生物制品质量控制指南（2023版）》、ISO11133:2014《食品、动物饲料和水的微生物学微生物培养基制备、生产、储存和性能测试的一般要求》、国家药监局《细胞治疗产品质量控制指导原则（试行）》。3人员要求3.1资质要求：所有从事细菌检查的人员应具备微生物学、药学等相关专业大专及以上学历，经生物安全操作、无菌检验技术、生物制品质量规范专项培训并考核合格，取得检验岗位上岗证后方可独立开展操作；每年应完成不少于40学时的继续教育，内容涵盖最新检验标准、生物安全防控、偏差处理规范，年度考核不合格人员暂停独立检验权限，经补考合格后方可恢复。3.2技能要求：操作人员应熟练掌握无菌操作技术、培养基制备、菌株传代保藏、细菌分离鉴定、偏差调查流程，关键操作（包括梯度稀释、滤膜转移、致病菌判定、结果复核）应每年开展实操考核，操作误差率不得超过5%。3.3健康与防护要求：在岗人员应每年开展健康体检，患有活动性呼吸道感染、消化道感染、皮肤创面未愈合的人员不得参与细菌检验工作；操作过程中应根据样本风险等级采取对应防护，检验普通非致病性样本时采用BSL-2级基础防护（穿分体无菌工作服、戴N95口罩、乳胶手套、护目镜），检验含潜在致病菌（如破伤风梭菌、沙门菌）的样本时应加穿防水隔离衣、鞋套，操作锐器时使用防刺伤工具。3.4复核要求：所有检验原始记录、结果判定需经具备5年以上生物制品微生物检验经验的主管检验师复核，双人签字后方可出具正式报告。4设施设备与环境要求4.1实验室分区：细菌检查实验室应符合生物安全二级（BSL-2）建设标准，采用独立洁净空调系统，严格分区设置：试剂准备区（洁净度B级，静态压差+10Pa，防止外部污染进入）、样本处理区（洁净度B级，静态压差-15Pa，防止样本气溶胶外泄）、微生物培养区（洁净度C级）、结果判定区、高压灭菌污物处理区。各区域物理隔断完全，标识清晰，专用工作服、专用设备不得跨区使用。4.2环境监控要求：实验室静态环境需满足以下指标：沉降菌（φ90mm平皿暴露30min）≤1cfu/皿，浮游菌≤10cfu/m³，接触面（接触皿法）≤5cfu/皿，尘埃粒子≥0.5μm的粒子数≤352000个/m³、≥5μm的粒子数≤2900个/m³。环境监控频次为：每次检验前开展动态沉降菌监控，每周开展接触面监控，每月开展全面环境指标检测，环境指标超标时应立即停止检验工作，开展消毒整改，复查合格后方可恢复使用。4.3设备管理要求4.3.1生物安全柜：采用II级A2型生物安全柜，安装位置远离实验室入口、通风口，避免气流干扰。每年开展1次校准，垂直气流风速控制在0.38m/s-0.5m/s，高效过滤器检漏漏率≤0.01%，每次使用前开机自净30min、紫外消毒30min，使用后用75%乙醇擦拭台面，运行10min后关机。4.3.2培养设备：需氧菌培养箱温度控制精度为36℃±1℃，厌氧菌培养箱温度控制精度为35℃±1℃，厌氧环境氧浓度≤0.5%，二氧化碳培养箱浓度控制精度为5%±0.5%。每7天校准1次温度，温度偏差超过±0.5℃时应停止使用，维修校准合格后方可恢复；每批次培养应放置温度记录仪，全程监控培养温度波动。4.3.3高压灭菌器：采用带有温度、压力、时间自动记录功能的高压灭菌器，灭菌参数为121℃、103kPa、15min（或115℃、68kPa、30min，适用于热敏性物品）。每次灭菌应放置嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953生物指示剂，灭菌后指示剂培养无菌生长视为灭菌合格；灭菌记录应至少保存5年。4.3.4其他设备：移液器每年校准1次，体积误差≤±0.5%；电子分析天平每年校准1次，精度达到0.1mg；菌落计数器分辨率≥1cfu，每季度开展计数准确性验证，误差率≤2%；所有计量设备应具备可溯源的校准证书。5试剂与培养基质量控制5.1培养基要求：优先选用符合中国药典要求的商品化成品培养基，自制培养基应严格按照中国药典配方制备，制备用水为电导率≤1.3μS/cm（25℃）的无菌纯化水，制备过程全程无菌操作，避免污染。5.2培养基性能验证：每批次培养基应开展无菌验证和促生长试验：无菌验证为取3份代表性培养基，36℃培养14天无微生物生长为合格；促生长试验接种对应标准菌株，回收率≥70%为合格：胰酪大豆胨琼脂（TSA）接种金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、枯草芽孢杆菌ATCC6633；硫乙醇酸盐流体培养基（FTM）接种金黄色葡萄球菌ATCC25922、生孢梭菌ATCC19404；麦康凯琼脂接种大肠埃希菌ATCC25922；甘露醇高盐琼脂接种金黄色葡萄球菌ATCC25923。5.3培养基储存与使用：干粉培养基按说明书要求阴凉干燥处储存，在有效期内使用；制备好的平板2℃-8℃密封储存，有效期不超过14天，液体培养基2℃-8℃储存有效期不超过30天。使用前应检查培养基是否有变色、沉淀、污染、干裂等情况，不符合要求的不得使用。5.4标准菌株管理：所有标准菌株应从中国食品药品检定研究院或美国典型培养物保藏中心（ATCC）采购，建立菌株溯源台账，记录菌株来源、传代次数、储存条件、使用日期。菌株传代次数不得超过5代（从官方提供的冻干菌株为第0代计算，工作菌株传代次数不超过4代），斜面菌株4℃储存有效期不超过1个月，甘油冻存菌株-80℃储存有效期不超过2年。每次使用前应划线分离培养，确认菌株纯度和生物学特性符合要求后方可使用。5.5鉴定试剂管理：革兰染色液、生化鉴定试剂、血清凝集试剂均应在有效期内使用，每批次试剂使用前开展阴阳性对照验证：革兰染色液用金黄色葡萄球菌（阳性）、大肠埃希菌（阴性）验证，染色结果符合要求后方可使用；生化试剂、血清试剂用对应标准菌株验证，反应结果符合说明书要求方可使用。6样本管理6.1样本采集：采样过程严格执行无菌操作，采样容器为经高压灭菌合格的无抑菌剂广口瓶或离心管，样本标识应包含产品名称、批号、批次规格、采样日期、采样部位、采样人信息。样本采样量为检验用量的3倍，其中1份用于检验，1份用于复核，1份用于留样：液体制剂每批次采样量不少于100ml，固体制剂不少于10g，注射用生物制品每批次采样不少于20个最小独立包装，细胞治疗产品每个独立批次采样量不少于2ml。生产环境样本采样：接触面采用φ55mm接触皿按压采样10s，工艺用水采样量不少于100ml，工艺用气采用六级筛孔撞击式采样器采样，采样流量28.3L/min，采样时间不少于10min。6.2样本运输与接收：样本采用2℃-8℃冷链运输，避免冻结或高温暴露，运输时间不超过24小时，冷链运输全程记录温度，温度偏离2℃-8℃超过2小时的样本判定为无效样本，不予接收。样本接收时应核对标识完整性、样本量、外观状态，存在容器破损、污染、标识不清、温度不符合要求的样本予以拒收，建立样本接收台账，记录接收日期、样本状态、接收人信息。6.3样本储存与留样：接收后的样本应在2小时内开展检验，无法及时检验的样本2℃-8℃储存不超过24小时，-20℃储存不超过7天，储存前应完成储存验证，确认储存条件不会对细菌计数和致病菌检测结果造成偏差。检验阴性样本留样至产品有效期后1年，检验阳性样本-20℃密封储存不少于6个月，用于偏差调查和溯源。7检验操作程序7.1检验前准备：操作人员按要求穿戴防护用品，进入实验室后首先对生物安全柜台面用75%乙醇或0.1%新洁尔灭擦拭消毒，开启生物安全柜自净和紫外消毒30min。所有进入生物安全柜的物品（包括移液器、枪头、培养基、样本、生理盐水）外表面均用75%乙醇擦拭消毒后方可放入。每批次检验需同时设置3类对照：空白对照（取对应培养基直接培养，结果应无菌落生长）、阴性对照（用无菌生理盐水代替样本，全程执行相同检验操作，结果应无菌落生长）、阳性对照（接种10cfu-100cfu对应标准菌株，检验过程同供试品，回收率≥70%判定为检验有效）。7.2需氧菌总数计数7.2.1方法选择：含菌量较高的原料、辅料、非无菌中间品采用平皿倾注法；含菌量较低的成品、注射用生物制品、工艺用水采用薄膜过滤法，两种方法均应完成方法学验证后方可使用。7.2.2平皿倾注法操作：取供试品1g或1ml，加入9ml无菌生理盐水，充分振荡混匀制成1:10供试液，按10倍梯度依次稀释至适宜稀释度（预计稀释后平皿菌落数在30cfu-300cfu之间）。每个稀释度取1ml供试液加入无菌φ90mm平皿，立即倾注15ml-20ml熔化后冷却至45℃的TSA培养基，轻轻转动平皿混匀，待培养基凝固后倒置放入36℃±1℃培养箱培养72小时±2小时。每个稀释度做2个平行平皿，同时做阴性对照。7.2.3薄膜过滤法操作：采用孔径0.45μm、直径47mm的无菌微孔滤膜，安装于无菌过滤器内，取供试品100ml（或按产品规定的检验量）加入过滤器，负压过滤完成后用100ml无菌生理盐水分3次冲洗滤膜，冲洗液量应经过验证，不会残留抑菌成分。取下滤膜，菌面朝上贴于TSA平板表面，避免产生气泡，倒置放入36℃±1℃培养箱培养72小时±2小时，每个供试品做2个平行滤膜。7.2.4计数规则：选取菌落数在30cfu-300cfu之间的平皿计数，蔓延菌落面积超过平板1/4的平板作废。两个平行平皿的菌落数相对偏差不得超过20%，超过时应重新检验。结果计算：细菌总数=平均菌落数×稀释倍数，结果保留两位有效数字，单位为cfu/g或cfu/ml。7.3厌氧菌总数计数采用厌氧琼脂培养基，操作步骤同需氧菌总数计数，接种后置于厌氧培养箱内（氧浓度≤0.5%），35℃±1℃培养120小时±2小时后计数，促生长试验接种生孢梭菌ATCC19404，回收率≥70%为检验有效。7.4致病菌检测7.4.1大肠埃希菌检测：取供试液10ml接种至100ml麦康凯肉汤培养基，36℃±1℃增菌培养18小时-24小时，划线接种至麦康凯琼脂平板，36℃±1℃培养18小时-24小时。典型菌落为红色、圆形、表面光滑、中等大小，挑取疑似菌落做革兰染色（革兰阴性杆菌）、氧化酶试验（阴性）、IMViC试验（吲哚阳性、甲基红阳性、VP阴性、枸橼酸盐阴性），结果全部符合判定为检出大肠埃希菌。7.4.2沙门菌检测：取供试品25g或25ml接种至225ml缓冲蛋白胨水，36℃±1℃预增菌18小时-24小时，转种至亚硒酸盐胱氨酸增菌液，36℃±1℃选择性增菌18小时-24小时，分别划线接种至HE琼脂平板和SS琼脂平板，36℃±1℃培养18小时-24小时。典型菌落为无色半透明、中心带或不带黑色沉淀，挑取疑似菌落做三糖铁试验（斜面变红、底层变黄、产酸产气、硫化氢阳性或阴性）、动力试验阳性、靛基质阴性、尿素酶阴性、VP阴性，再采用沙门菌O抗原、H抗原诊断血清做凝集试验，阳性者判定为检出沙门菌，所有生物制品均不得检出沙门菌。7.4.3金黄色葡萄球菌检测：取供试液10ml接种至100ml7.5%氯化钠肉汤培养基，36℃±1℃增菌18小时-24小时，划线接种至甘露醇高盐琼脂平板，36℃±1℃培养24小时-48小时。典型菌落为黄色、圆形、周围有黄色浑浊圈，挑取疑似菌落做革兰染色（革兰阳性球菌，呈葡萄串状排列）、血浆凝固酶试验（取0.5ml兔血浆加入0.5ml菌液，36℃培养6小时，血浆凝固为阳性），阳性者判定为检出金黄色葡萄球菌，注射用、眼科用、外用生物制品均不得检出。7.4.4铜绿假单胞菌检测：取供试液10ml接种至100ml胰酪大豆胨肉汤，36℃±1℃增菌18小时-24小时，划线接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂平板，36℃±1℃培养18小时-24小时。典型菌落为扁平、边缘不整齐、产生绿色水溶性色素，挑取疑似菌落做氧化酶试验（阳性）、绿脓菌素试验（阳性）、42℃生长试验（阳性），阳性者判定为检出铜绿假单胞菌，注射用、眼科用、创面用生物制品均不得检出。7.4.5破伤风梭菌检测：取供试液5ml接种至硫乙醇酸盐流体培养基，35℃±1℃厌氧培养24小时-48小时，涂片做革兰染色，可见革兰阳性杆菌、芽孢位于菌体一端呈鼓槌状，转种至庖肉培养基厌氧培养3天-5天，产生气体、肉渣不消化、有腐败性臭味。取培养物上清0.2ml腹腔注射体重18g-22g小鼠，同时设置对照组（注射培养物+破伤风抗毒素），观察3天，试验组小鼠出现强直性痉挛、死亡，对照组小鼠全部存活，判定为检出破伤风梭菌，创伤用生物制品、血液制品均不得检出。7.5方法学验证：首次使用的检验方法、新产品检验、产品生产工艺发生重大变更时，应开展方法学验证，验证内容包括：专属性（不应与其他微生物发生交叉反应）、准确度（加标回收率70%-130%）、精密度（6次平行检验相对标准偏差≤20%）、检测限（致病菌检测限≤10cfu/10g或10ml）、耐用性（培养时间±2小时、培养基批次变更时结果无显著性差异）。验证报告经质量部门批准后方可采用该方法开展检验。8结果判定与偏差处理8.1结果判定：检验结果应符合对应产品的法定质量标准及企业内控标准，常见类别产品细菌指标要求如下：（1）注射用无菌生物制品：需氧菌总数≤10cfu/100ml，厌氧菌总数≤10cfu/100ml，所有规定致病菌不得检出；（2）口服生物制品：需氧菌总数≤10³cfu/g，大肠埃希菌≤10cfu/g，沙门菌不得检出；（3）外用生物制品：需氧菌总数≤10²cfu/g，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌不得检出；（4）生产用原料、辅料、中间品的细菌指标应严于成品内控标准，具体要求由企业自行制定并验证。8.2超标结果（OOS）处理：检验结果超出标准时，应立即启动OOS调查程序，首先开展实验室内部调查，内容包括：检验操作是否符合规范、培养基是否合格、对照结果是否符合要求、环境监控是否达标、样本是否存在污染，排除实验室因素后，采用同批次留样样本开展复核检验，复核检验由2名资深检验人员独立操作，结果均符合标准可判定为首次检验误差，结果仍超标的判定为产品不合格。不合格产品应立即上报质量受权人，启动产品召回、追溯程序，同时开展生产工艺调查，查找污染原因，制定整改措施并验证整改效果。8.3报告管理：检验报告应