CN119452225A 通过电流体动力学的封装方法 （科·汉森有限公司）

2024.12.27PCT/EP2023/0661362023.06.15WO2023/242349EN2023.12.21本公开内容涉及利用高压电源提供的静电电荷对具有特定表面电荷的活微生物进行静电23.根据权利要求1或2中任一项所述的方法表面电荷相比具有相反电荷的收集器实现所述干燥颗粒4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中具acidophilus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia11.正电荷或负电荷高压电源封装具有表面电荷的活微生物的用途，所述表面电荷与3[0001]本公开内容涉及用于对微生物进行静电喷雾干燥的方法和包埋于干燥颗粒中的[0003]喷雾干燥是其中将悬浮液雾化(或喷雾)并且然后使用气态热干燥介质快速干燥然需要提供改进的静电喷雾干燥方法，且特别是导致节约成本和/或提高最终产品稳定性[0007]已观察到喷雾干燥过程中的电场和电荷极性可以通过利用电流体动力学影响纳方法包括以下步骤：a)提供悬浮液，该悬浮液包含具有表面电荷的微生物和制剂助剂4菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠杆菌([0014]在一个实施方案中，微生物是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis[0020]根据本发明的第二方面，提供了正电荷或负电荷高压电[0027]图2是显示极性对EHD干燥的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力(B)的影响的两张[0028]图3是显示针与样品架之间的距离对EHD干燥的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力[0029]图4是显示温度对EHD干燥的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力(B)的影响的两张图。[0030]图5是显示针的数量和针与移动过滤器之间的距离对EHD干燥的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力(B)的影响的两张图。结果与参考样品(R0)之间显示出统计学显著差异(p<[0031]图6是显示针的数量和针与移动过滤器之间的距离对EHD干燥的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力(B)的影响的两张图。结果与参考样品(R0)之间显示出统计学显著差异(p<[0032]图7是显示不同的干燥设置对干燥2小时的BIFIDO益生菌失水量(A)和活力(B)的5[0034]图9是显示在添加和不添加麦芽糊精的情况下干燥2小时的BIFIDO益生菌的FTIR[0035]图10是显示不同干燥设置对干燥2小时的BIFIDO益生菌的ζ电位(A)和疏水性(B)的影响的两张图。结果与参考样品(R0、R17)之间显示出统计学显著差[0036]图11是显示益生菌在[0037]图12是显示益生菌细胞在不同pH情况下的细胞表面疏水性(以十六烷黏附％表[0040]图15是显示电场极性和电压对电喷雾微胶囊的玻璃化转变温度(Tg)的影响的两[0042]图17是显示使用负极性和正极性电喷雾的封装细胞以及非封装细胞(游离细胞)[0046]还可以利用电流体动力学获得具有靠近颗粒表面而不是在颗粒核心的微生物的使得其作用是在静电喷雾干燥过程本身中，以及还在随后使用所述干燥颗粒和/或微生物[0048]本发明还涉及包含包埋于大量制剂助剂中的活微生物的颗粒。颗粒优选是密实6[0049]在本公开内容的实施方案中，施加静电电荷使得极性组[0055]在本公开内容的另一个实施方案中，电极相对于接地的电位差随时间而发生变7冲之间的时间可以是设定值，或可以取决于本文其他地方提到的处理方法的参数而变化。用于增加溶剂的蒸发和/或增加微生物的封装。悬浮液组分的分配可以导致形成的液滴具述组分的介电特性和/或有效介电特性之间[0060]在本公开内容的实施方案中，微生物具有低于制剂助剂和/或溶剂的有效介电特助剂具有高于微生物的介电特性。微生物的介电特性可以作为有效介电特性来测量和/或本领域技术人员已知的，例如在Sanchisetal.,Dielectriccharacterizationofbacterialcellsusingdielectrophoresis,Bioelectromagnetics,2008约20℃至约200℃的范围，例如约40℃至约150℃的范围，或例如约40℃至约120℃的范围，例如约40℃至约90℃,例如约50℃至约90℃,例如约60℃至约85℃,例如约80℃的雾化气体的具体特性(例如微生物的光学封装)、干燥颗粒[0069]在本公开内容的实施方案中，雾化气体具有约1kPa至约500kPa的范围，例如约[0070]在本公开内容的实施方案中，雾化气体具有约50kPa至约400kPa的范围的入口压9w)是物质中水的分蒸中相对于干燥颗粒的总重量，干燥颗粒的溶剂(例如水)含量按重量计低于约20例如按重量计低于约15例如按重量计低于约10例如按重量计低于约5例如按重量计低[0081]在本公开内容的实施方案中，使用具有约40微米至约300微米范围的孔径的筛子[0089]麦芽糊精(葡萄糖当量12(DextroseEquivalent12))，商业名称为Glucidex胰蛋白胨(Oxoid,Hampshire,UK)等渗溶液，用于细菌稀释。使用双重染色LIVE/DEADTMBacLightTM细菌活力试剂盒(L一7012,MolecularProbes,Eugene,OR,USA)进行细菌活力测量。浓度为3x1011个细胞/克的益生菌细胞即动物双歧杆菌DSM15954(下文中称为[0091]在室温将在80℃储存的益生菌(3x1011个细胞/克)解冻，并转移(5g)到55mmx[0092]EHD干燥装置由与计算机连接的单极DC高电压发生器(GammaHighVoltageResearch,Florida,USA)组成，该计算机执行一种算法以控制施加于三根金属针(直径[0100]在室温将在80℃储存的益生菌(3x1011个细胞/克)解冻，并转移(5g)到55mmx[0103]使用精度为0.001g的数字天平(MettlerToledo,Greifensee,瑞士)测量样品的初始重量及其随后在EHD干燥1小时和2小时后的重量。样品干燥实验的失水量(WL)百分比将样品的细菌浓度调整为约1x103至5x106细胞/毫升，并为SYTO9和PI染色的细菌定义适当[0109]在室温(25℃)，用FT_IR光谱仪(NicoletiS50,ThermoFisherScientific,[0111]将浓度为约108个细胞/mL的BIFIDO干燥细胞悬浮在10mMKH2PO4(Sigma_AldriPanalyticalLtd,Malvern,UK)中。样品的电泳迁移率利用Zeta_sizer(Malvern[0113]通过微生物黏附十六烷(MATH)测定(Deepikaeta到吸光度(OD600)为约0.8。将等体积的2mL细菌细胞悬浮液和十六烷(ThermoFisher[0118]结果以平均值±标准偏差(SD)表示。为了分析样品间的差异，采用了单因素[0125]已显示对于相同的电压，负电晕产生的电晕电流比正电晕更高(LaiandWong[0127]图3A示出，电压从3.7kV增加到4.7kV，样品S7和S3在干燥1h后的失水量分别从增强电场，从而提高干燥速率(Anukiruthika,Moses,andAnandharamakrishnan2021；S7与参考物R0在失水量方面没有呈现出显著差异(WL＝11.1±1.6％(1h),WL＝19.5±的水蒸发在干燥的第一小时就达到了与两小时后S11相同的损失量(WL＝66.9±4.8%[0140]为了改进益生菌的干燥，添加了移动隔室，以便周期性移动平端面电极(flat滤器_网状电极确实促进了气流并增强了水蒸发(MujumdarandXiao2019；Iranshahi,[0146]与不含麦芽糊精的相应MF4或FD样品相比，添加麦质表面的水通量降低，从而限制了蒸发速率和所选干燥时间内的失水量(Gianfrancesco品并非像通过电流体动力学或冷冻干燥处理[0150]未干燥的细菌的光谱中不存在3000cm_1和2800cm_1之间的脂肪酸区域，但所有干明显的证据表明蛋白质的二级结构受到了施加EHD干燥或冷冻干燥过程的影响，因为没有动，而对于所有样品，都在1100_980cm_1频率处观察到宽的碳水化合物和磷酸盐带。在1070cm_1和1040cm_1处观察到最大透射率，这是由于磷脂双层极性位点的C_O_C基团振动如Bozkurt等人(Bozkurtetal.2[0152]具有和不具有麦芽糊精的情况下EHD干燥样品与冷冻干燥样品的比较在(图9)中的增加会增加酰胺I的吸收带。1394_1310cm_1处较宽的峰以及1210cm_1处的额外小峰和主导的C_O_C、C_O带。此外，细菌包膜的PO2与麦芽糊精的相互作用通过从干燥BIFIDO的1040cm_1到具有BIFIDO和麦芽糊精的样品的1020cm_1的较低频率的改变来体现。后者可以通过注意到麦芽糊精带从995cm_1位如强酸(基于磷酸的(脂)磷壁酸)和弱酸(酸性多糖和蛋白质)的优势(DeepikaetR0以及不含麦芽糊精的EHD干燥或冷冻干燥样品(S1和FD)，与含有麦芽糊精的相应样品过程中会形成更稳定的簇。因此可以假定，糖与细菌表面的相互作用可以稳定细菌表面[0159]此外，在同一样品中添加麦芽糊精增加了BIFIDO的疏水性。根据Shakirovaet许多其他研究已表明，(糖)蛋白质物质和多糖的存在分别是疏水性和亲水性较高的原因使用设置1的优化条件允许达到70％干燥和高达34％的细胞活力。通过用麦芽糊精分散益[0164]益生菌细胞动物双歧杆菌，DSM15954(下文称为BIHorsholm,丹麦)提供。具有葡萄糖当量12的麦芽糊精(GlucidexIT12,Roquette,作悬浮介质，以用于评估细菌表面特性；并且十六烷(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)用于进行疏水性测量。菌活力试剂盒(L_7012,MolecularProbes,Eugene,OR,USA)进行。荧光染料噻唑橙Zeta_sizer(MalvernPanalyticalLtd,Malvern,UK)测定。将体积为1mL的样品注入带有镀金铍/铜电极的折叠毛细管池(DTS1070样品池，MalvernPanalyticalLtd,Malvern,将电泳迁移率转换成ζ电位。[0172]其中，A0是细菌悬浮液的初始吸光度，且A1是孵育20min和相分离后的吸光度[0175]将麦芽糊精(75％w/v)分散在Millipore水(Milliporewater)中并搅拌，直至获[0176]电喷雾装置包括高电压发生器(ES50P_10W,GammaHighVoltageResearch,Inc.,USA)以提供15_40kV的电压和注射泵(NewEraPumpSystems,Inc.,Farmingdale,[0179]使用倒置ZeissLSM_710共聚焦激光扫描显微镜(CarlZeissMicroImaging都是在488nm的激发波长和505_550nm的发射带通滤光片下采集的。使用ZEN软件，分析图[0181]使用NicoletiS50光谱仪(ThermoScientific,NY,USA)，以衰减全反射(ATR)模式在400_4000cm_1范围内记录样[0184]进行了差示扫描量热法(DSC)实验以确定电喷雾微胶囊的玻璃化转变温度(Tg)。使用配备有RefrigeratedCoolingSystem90的DSC250(TAInstruments,NewCastle,[0185]将约5mg的电喷雾微胶囊(处理后立即收集)放入预先称重的标准DSC铝制平底锅(Tzero铝制密封平底锅(TzeroaluminumHermeticpans)，TAInstruments,USA)中并密至少30℃。作为参考样品的非封装动物双歧杆菌于25℃储存在相对湿度为35±2％RH的培养箱(型号KB8400F,A/SNinolab,solrodStrand,丹麦)中。通过菌落形成单位(CFU)分析测定了封装和非封装BIFIDO细胞的活力随时间变化(0_14天)。特别地，将电喷雾微胶囊分散在将0.1mL适当的十倍系列稀释液涂布在补充有0.05w/V％L_半胱氨酸盐酸盐一水合物(Merck,Kenilworth,NJ,USA)的deManRogosaSharpe(MRS)琼脂平板上。将MRS琼脂平板[0189]微胶囊的封装效率(EE)是用胶囊内的活细胞数(N)除以初始溶液中的活细胞数[0195]图11显示了磷酸二氢钾缓冲液中BIFIDO的ζ电位随pH的变化。细胞表面的电负性前针对其他双歧杆菌属菌株(双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum))报道过类似的ζ电位特征(GómezZavagliaetal.,2002)，这是因为细胞的表面组分以阴离子域(包括强酸(基于磷酸的(脂)磷壁酸)和弱酸解释细菌的电负性因pH的降低而降低(Pelletie40％。BIFIDO细胞表面存在的共价结合蛋白、S层蛋白和脂肪酸(Dianawati&Shah,2011；Shakirovaetal.,2010,2013)已被提出促进对疏水性溶剂的黏附并有助于提高细菌的疏[0198]通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)研究了电场的负极性和正极性对pH6的电喷面带负电荷的BIFIDO细胞(pH6)受到针壁和泰勒锥(Taylorcone)内表面的带负电荷电场[0200]图14显示了不同pH值的情况下电喷雾麦芽糊精/BIFIDO分散体的CLSM。与在pH6[0202]还评估了电压和电场极性对麦芽糊精_BIFIDO电喷雾胶囊玻璃化转变温度(Tg)的干燥状态下储存细胞期间的稳定性，需要去除足够的水并形成非结晶玻璃状固体基质芽糊精_BIFIDO胶囊的特征在于，其Tg值远高于负极性电场电喷雾的(表面带负电荷的)益生菌细胞受到排斥并在胶囊的核心发生“自组[0205](不同电场极性影响下)(非封装)电喷雾BIFIDO以及未用外部电场处理的BIFIDO