T∕NXSLX 0403-2025 非洲猪瘟病毒（ASFV I 型毒株、ASFV II 型毒株混合或 ASFV I II 型嵌合毒株）实时 荧光定量 PCR 检测技术规程

ICS11.220CCSB41NXSLXT/NXSLX0403—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提出。本文件由宁夏饲料工业协会归口。本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、青岛立见生物科技有限公司、惠农区动物疾病预防控制中心、贺兰县农业技术推广服务中心、同心县动物疾病预防控制中心。本文件主要起草人：马龙、李莉、艾文、葛栋、李知新、张玉玲、尹才、罗龙龙、靳善来、吴绿怡、吴昊林、陈思思、裴元礼、任子煜、路静、王晓亮、周海宁。T/NXSLX0403—2025型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测技术规程本文件规定了非洲猪瘟病毒（ASFVI型毒株、ASFVII型毒株混合或ASFVI&II型嵌合毒株）实时荧光定量PCR检测时的实验室检测样品采集及处理、荧光定量PCR方法、结果判定、注意事项。本文件适用于猪全血、血清、口鼻拭子、组织、环境拭子等样本中的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18648-2020非洲猪瘟诊断技术GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3缩略语下列缩略语适用于本文件。4生物安全措施进行ASFV实时荧光定量PCR检测时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB/T19489执行。5实验室检测样品采集及处理5.1试剂5.1.10.1mol/LPBS(pH7.4).配制方法见附录A的A.1。5.1.20.4mol/LPBS(pH7.4).配制方法见A.2。5.1.350%甘油-PBS保存液.配制方法见A.3。5.2采样用具5.2.1器械：剪刀、镊子、组织匀浆器等。5.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2ml、5ml、10ml）、样品保存管等。5.2.3个人防护用具：防护服、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。5.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。5.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。5.3样品采集T/NXSLX0403—20255.3.1全血样品采集在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5ml，密封后冷藏或冷冻保存。5.3.2血清样品采集在每一发病猪中，采集发病猪、同群猪全血各5ml，室温放置12~24h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。5.3.3口、鼻拭子采集采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物；蘸取分泌物后，立即将拭子侵入1ml50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏冷冻保存。5.3.4组织样品采集采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏等。脾脏、肾脏采集约3cm×3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集。将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。5.3.5环境拭子采集采集病死猪或发病猪、同群猪圈内地面周边环境拭子样品。用医用棉签在圈内四周和中间方向蘸取污染物，立即将所采集样品拭子侵入1ml50%甘油-PBS保存液中。5.4样品处理5.4.1全血样品处理全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。5.4.2血清样品处理血清标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。5.4.3口、鼻拭子处理口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。5.4.4组织样品处理取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4)制备10%组织匀浆液。2000r/min离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。5.4.5环境拭子处理环境拭子样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。6荧光定量PCR方法T/NXSLX0403—20256.1试剂6.1.1DNA提取试剂盒。6.1.2无核酸酶水，配制方法见附录B的B.1。6.1.3荧光PCR预混液（2×)。6.2仪器设备6.2.1荧光PCR扩增仪。6.2.2高速冷冻离心机（最大离心力12000g以上）。6.2.4无核酸酶离心管与吸头。6.2.5PCR扩增管。6.3引物探针引物探针是根据已发布的毒株序列进行设计。上游引物ASFVIF：5'-CCCCTGAAATACACAACCTTTTTG-3'；下游引物ASFVIR：5'-CACCTGCGTTTTATGGACACGTA-3'；TaqManASFVIT：FAM-TTCGCTTCTCGCTGA-MGB。上游引物ASFVIIF：5'-TAACCCCTGAAATACA5'-ACCTGCGTTTTATGGACACGTA-3'；TaqManASFVIIT：VIC-TTCGATTCTCCCTGA-MGB。上游引物ASFVI&IIF：5'-GAAGAAGAACAATGTCAGCATGATG-3'；下游引物ASFVI&IIR：5'-CGACTGTAAGGCTTAGGAAGTAATGG-3'；TaqManASFVI&IIT：Cy5-CACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGA-BHQ2。6.4试验程序6.4.1核酸提取采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20℃冰箱保存。每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本（全血、血清、10%组织匀浆上清液）；阴性对照样品应为无核酸酶水。6.4.2核酸扩增6.4.2.1扩增体系6.4.2.1.1每个样品配制20μL荧光PCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水7.22μL荧光PCR预混液（2×)12.50μLASFVIF（10μmol/L）0.10μLASFVIR（10μmol/L）0.10μLASFVIT（10μmol/L）0.08μL6.4.2.1.2每个样品配制20μL荧光PCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水7.20μL荧光PCR预混液（2×)12.50μLASFVIIF（10μmol/L）0.10μLASFVIIR（10μmol/L）0.10μLASFVIIT（10μmol/L）0.10μL6.4.2.1.3每个样品配制20μL荧光PCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水7.25μL荧光PCR预混液（2×)ASFVI&IIF（10μmol/L）0.10μLASFVI&IIR（10μmol/L）0.10μLASFVI&IIT（10μmol/L）0.05μLT/NXSLX0403—2025将20μL荧光PCR反应混合液加入PCR扩增管；将5μLDNA模板加入每个PCR扩增管中，每次进行荧光PCR扩增时均应设阳性、阴性和空白对照。以标准物质、标准品或已知序列的质粒作为阳性对照模板，阴性对照和空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放入荧光PCR扩增仪中。按5.4.2.2运行扩增程序。6.4.2.2扩增条件37℃孵育2min；95℃预变性20s；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共40个循环；在每一循环的60℃时收集FAM、VIC、Cy5荧光信号。7结果判定7.1试验成立条件结果的有效性FAM信号通道、VIC信号通道下、Cy5信号通道下，阳性对照均出现特异性扩增曲线且Ct值≤35，且阴性对照均无特异性扩增曲线或均无Ct值，则试验结果有效；否则应重新进行试验。7.2结果描述及判定7.2.1FAM信号通道符合7.1的条件，样品的扩增结果有特异性扩增曲线且Ct值≤38时，可判定为该通道核酸阳性；样品的扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，可判定为该通道核酸阴性；样品的扩增结果有特异性扩增曲线且38＜Ct值≤40时，可初步判定为该通道核酸可疑；对初步判定可疑样品可进行复检，若复检的Ct值≤40，且出现特异性扩增曲线，最终判定为该通道核酸阳性，扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，最终判定为该通道核酸阴性见附录C。7.2.2VIC信号通道符合7.1的条件，样品的扩增结果有特异性扩增曲线且Ct值≤38时，可判定为该通道核酸阳性；样品的扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，可判定为该通道核酸阴性；样品的扩增结果有特异性扩增曲线且38＜Ct值≤40时，可初步判定为该通道核酸可疑；对初步判定可疑样品可进行复检，若复检的Ct值≤40，且出现特异性扩增曲线，最终判定为该通道核酸阳性，扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，最终判定为该通道核酸阴性见附录C。7.2.3Cy5信号通道符合7.1的条件，样品的扩增结果有特异性扩增曲线且Ct值≤8时，可判定为该通道核酸阳性；样品的扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，可判定为该通道核酸阴性；样品的扩增结果有特异性扩增曲线且38＜Ct值≤40时，可初步判定为该通道核酸可疑；对初步判定可疑样品可进行复检，若复检的Ct值≤40,且出现特异性扩增曲线，最终判定为该通道核酸阳性，扩增结果无特异性扩增曲线或无Ct值时，最终判定为该通道核酸阴性见附录C。8.注意事项本方法样品处理过程中使用的器械和容器，应高压灭菌处理；在荧光PCR反应中使用过的枪头和PCR扩增管，禁止高温高压处理，应用2%的84消毒液或新洁尔灭溶液浸泡30min后，再作为医疗废弃物处理。T/NXSLX0403—2025（规范性附录）样品保存液的配制方法A.10.1mol/LPBS(pH7.4)氯化钠（NaCl）85.00g磷酸氢二钠（Na2HPO4）磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.03g加去离子水至A.20.4mol/LPBS(pH7.4)0.1mol/LPBS400mL去离子水600mL103kPa高压蒸汽灭菌30min，室温或4℃冰箱保存。A.350%甘油-PBS保存液0.4mol/LPBS与纯甘油等量混合，调整PH值至7.4，分装小瓶。103kPa高压蒸汽灭菌30mi