高中生物选修1学案 5-3血红蛋白的提取和分离

课题3血红蛋白的提取和分离

一、学习目标：

本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大

分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习

运用这些技术打下基础。

二、重点：

凝胶色谱法的原理和方法

三、难点：

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【基础梳理】

一、凝胶色谱法

1、概念：也称做：是根据分离蛋白质的有效方法。

2、原理

（I）由构成的凝胶，内部有许多贯穿的的。

（2）当__________________不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_______的蛋白质容易

进入凝胶内部的通道，路程,移动速度，而相对分子质量_______的蛋白质

无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程,移动速度,从而

使不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1、作用：在一定范围内，抵制的对溶液pH的影响，维持pH。

2、配制：由种缓冲剂溶解于中配制而成，通过调节缓冲剂的就

可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

三、电泳

1、概念：指在电厂的作用下发生_________的过程。

2、原理：在一定的下，、等生物大分子的可解离基团会带上

或,在_________的作用下，这些带电分子会句者与其所带电荷的

电极移动。

3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、_

的不同，使带电分子产生不同的.从而实现样品中的.分离。

4、方法：常用的电泳方法有和o测定蛋白质分子量时通常使用。

四、实验操作

1、样品处理:通过、、等操作收集血红蛋白溶液。

(1)红细胞的洗涤：目的是。分离时采取,直至上清液中没

有，表明红细胞已洗涤干净。

(2)血红蛋.白的释放：在和的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液：把离心后，将试管中的液体用过滤、除去_

，于中静置片刻后，分离出下层的0

2、粗分离：即透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入,将放入一定量适宜浓度的中，

透析0

(2)目的：将的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

(1)凝胶色谱柱的制作。

(2)凝胶色谱柱的装填

①材料：本实验使用的是。

②方法：凝胶用充分溶胀后。配成，一次性倒人色谱柱内。

不能有存在：不能发生________流干露出凝胶颗粒的现象。

(3)样品的加入和洗脱

①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平

齐，关闭出口。

b、加样：用小心地将1mL透析后的样品加到的顶端，注意不要破

坏。

c、加样后：打开下端出口，使样品渗入.内。

②洗脱：加入，打开下端出口，进行.

4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是。

五、操作提示

1、红细胞的洗.涤：、与十分重要。过少，无法除

去血浆蛋白：过高和过长会使等一同沉淀，达不到分离效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在一____中膨胀，可以将加入其中

的

用加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白

质的，降低。

4、蛋白质的分离：如果红色区带地移动，说明色谱柱制作成功“

【探究归纳】

一、人们用鸡的红细胞提取DNA,而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸储水代替生理盐水？

三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸僧水和甲茶的目的是什么"

四、凝胶色谱法的原理归纳

【典例导析】

类型一凝胶色谱法分离蛋白质

［例I］凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不

需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，日前已经被生物化学、分子生物学、生物

工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，

而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是,原因是_

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由

___________________替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是

（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体（填“相同”或“不同”），洗

脱时，对洗脱液的流速要求是,

【思路点拨】用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分

子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所

以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒

的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进

入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落

后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的

空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,

降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一

旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

互动探究

(1)凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗？

(2)题目中a和b的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗.？

(3)除了题目中提到的气泡需要重装以外，还有哪种情况需要重装？

类型二探讨电泳的原理

【例2】蛋白质分子中，氨基酸的Q-氨基和Q-按基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质

分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的级基和竣基、天冬经酸和谷缎

酸残基中的陵基、赖凝酸和组原酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸

性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷：在碱性溶液中酸性基团•的解离力口强,

使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而

呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、

负电荷量是不相同的。试回答下列问题：

(1)多数蛋白质的等电点近于5,一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点(“偏高”

还是“偏低”)。

(2)根据等电点的不同，你能用方法将不同种类的蛋白质分子分开。

⑶简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分.子的原理。

【思路点拨】本题深入到蛋白质内部，从蛋白质分子带电性质及数量的角度，引导学生理解

电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，

蛋白质带正电荷。要使蛋白及内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶•液的

pH,使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将

特定的蛋白质分离出来。

【提能演练】

一、选择题

1、凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类较多“但其作月的共同点是（）

A、改变蛋白质分子通过凝胶时的路径

B、吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度

C、将酶或纽胞固定在凝胶中

D,与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度

2、下列各项中，一般不影响凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是（）

A、层析柱高B、层析柱的直径

C、缓冲溶液D、样品的分布

3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是（）

A、蛋白质分子所带的电荷

B、蛋白质分子的形状

C、蛋白质分子的相对分子质量

D、缓冲溶液的pH

4、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是

A、要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠

B、取血回来后，马上进行高速长时问离心

C、将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌

D、重复洗涤直到上清液呈红色为止

5、下面说法不正确的是（）

A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B、缓冲溶液通常由1〜2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D、透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

6、蛋白质的提取和分离分为哪几步（）

A、样品处理、凝胶色谱操作.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

7、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是

A、低速长时间离心B、低速短时间离心

C、高速长时间离心D、高速短时间离.心

8、凝胶色谱法分离蛋白质中使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG—75),其中G、75

的含义为()

A、G表示凝胶的使用量，75表示加25g水

B、G表示凝胶的交联程度，？5表示需加热到75℃

C、G表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7、5g

D、G表示凝胶的膨胀体积,75表示每克凝胶膨胀时体积可达75cm3

二、非选择题

9、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图

I)和洗脱(图H)示意图，请据图回答下列问题。

(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是0

(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是

①o②贴着管壁加样、③o⑶

等样品o时，才加入缓冲液。

待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，

每mL收集一管，连续收集。

10、PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜匕并加上直

流电场，可利用分子带电荷不同分离和分析然基酸和多核甘酸片段等有机物。这两项技术综

合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。如图是一次寻找嫌犯的测试结果：图申是把遗

迹中含有21个氨基酸的多肽造行水解，将氨基酸混合物

进行电泳的结果：图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四

位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行

电泳所得到的一组DNA指纹图谱。乙：DNA指纹图谱

为待测男性。

混合物电泳结果(FLF］

(1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的以其中一位是B)

及、不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。

(2)在电泳过程中，带电分子会向着的电极移动。

(3)由图甲得知，多肽由种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是。

11、(能力拔高题)测定蛋白质的相对分子质量是研究蛋白质的一项重耍技术，常用凝胶(由多

孔性网状物质构成的颗粒，其孔能让小分子物质进出)过滤法测定，即在一根垂直的玻璃柱

中装满凝胶，然后在其上端加入蛋白质混合液并用缓冲液进行洗脱。根据各种蛋白质洗脱的

先后顺序可以比较它们的相对分子质量大小。利用下列材料，鉴定样品液(含有A、B两种相

对分子质量大小不同的蛋白质)中蛋白质相对分子质量的大小。

材料用具:支架台、符合要求的凝胶柱、吸管、缓冲液洗脱瓶、带有开关的玻璃导管、橡胶

软管、夹子、试管若干、足量的缓冲液等。

⑴实验步骤：

①加样前先0

②加样：0

③洗脱：o

④收集并检测它们洗脱的先后顺序。

(2)实验结果及结论：o

(3)请用坐标图表示出不同蛋白质相对分子质量大小与洗脱液体积的关系：

12、(2008•山东高考)科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的

抗菌能力，受到研究者重视。

(1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的、人小及形状不同，在

电场中的不同而实现分离。

⑵可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和

蛋白陈主要为细菌生长提供和。

⑶分别在加入和未加入该抗齿蛋白的培养基中接种等量菌液。培养一定时间后，比较两种

培养基中菌落的，确定该蛋白质的抗菌效果。

(4)细菌培养常用的接种方法有和o实验结束后，对使用过的培养基应进

行处理。

思考1:分离生物大分子的基本思路是什么？

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

思考2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和

吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。

思考3：高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？

变性、变性、空间结构

思考4：人们用鸡的红细胞提双DNA,用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA,使于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构

简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白

一、基础知识：

㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、概念：根据被分离蛋白质的（），利用具有网状结构的凝胶的分子筛

作用，来分，离蛋白质的有效方法。

2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白

质容易进入凝胶内部的通道，路程（）,移动速度（.）,而

（）的蛋白质无法进入;疑胶内部的通道，只能在（.

;）移动，路程（），移动速度（）,相对分子质量不同的蛋

白质因此得以分离。

3、具体过程：

A.的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留;

的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。

B.（1）混合物上柱；

（2）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内：

的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；

（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。

（4）不同的蛋白质分子完全分开；

（5）肉蛋白质行程较短，已从中洗脱出来,的

蛋白质还在行进中。

㈡缓冲溶液：

1、概念：在一定的范围内，隹对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明

显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵制（）的对溶液的（）

的影响,维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以

制得（）使用的缓冲液。

思考：说出人体血液中缓冲对？

思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常

结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）

㈢电泳：

1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等.都具有

（）在（一___________________）下，这些基团会带上

（）0在电场的作用下，这些带电分子会向着与其

移动。甩泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分

子本身（）、­:）的不同使带电分子产生不同的

（），从而实现样品中

各种分子的分离。

3、分类：

［琼脂糖凝胶电泳

1聚丙稀酰胺凝胶电泳。

测定（蛋白质相对分子质量）通常用十二烷

基硫酸钠（SDS）一聚丙稀酰胺凝胶电泳

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

它所.带静电荷的多少以及分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移咫的影响可以在

凝校电泳原理示意图

凝胶中加入（）。SDS能使蛋白质发生

完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定

的结果只是（.）。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质一SDS复

合物，SDS所.带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质

间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。

二实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化一纯度鉴定

1.样品处理

（1）红细胞的洗涤

①目的：去除（）

②方法：（）离心（速度越.高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞

等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（）,

将下层（）的红细胞液体倒入（）

再加入用（）的（）质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤

⑤低速离心（低速短时间）

⑥重复4、5步骤（）次，直至上清液中已没有（）,表明洗涤干净。利于

后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

（2）血红蛋白的释放

加（）到（）体积，再加40%体积的（）

（溶解细胞膜），置于（）上充分搅拌10分钟（加速细胞破

裂），细胞破裂释放出血红蛋白.

（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2（N）0r/min的速度离心lOmin,

试管中的溶液分为4层：

笫1层（最」一层）：（）甲苯层

第2层（中上层）：（）的沉淀层，（―）色薄层固体

第3层（中下层）：（）的水溶液层，（）的液体

第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层

（4）透析

2.凝胶色谱制作

1）凝胶色诺柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔挖已凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100

日尼龙纱包好。

a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔：

b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（）,在0.5ml的（）头部切下（）长

的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（）的尼龙纱将橡皮塞（）包

好•，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做（）,连接一细的（）,并用螺旋夹控制尼

龙管的（）,另一端放入收集（）的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述二者按相应位置组装成一个整体八

⑤安装其他附属结构。

2）凝胶色谱柱填料的处理

（1）凝胶的选择：（）。

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成

（）o

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：将（）一次性的缓慢倒入（）内，装填时轻轻敲

动色谱柱，使凝胶填装均匀。

③洗涤平衡

装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在（）高的操作压下，用300ml的20mm01/1的

磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（）12小时。

3）样品加入与洗脱

（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与

<）平齐，关闭出口

<2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加透析样品：用（）将1ml（）的样品加