TGBC-水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法 液相色谱-串联质谱法编制说明

团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》编制说明（征求意见稿）工作简介任务来源根据《广西物品编码与标准化促进会关于下达2025年第九批（共2项）团体标准制修订项目计划的通知》（桂标促〔2025〕035号）文件精神，由广西壮族自治区产品质量检验研究院提出，南宁市疾控中心、广西皇氏乳业有限公司共同起草的团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》（项目编号2025-22）。起草单位、主要起草人（姓名、单位、职务/职称、参与编制标准分工情况）等本文件由广西壮族自治区产品质量检验研究、南宁市疾控中心、广西皇氏乳业有限公司共同起草。主要起草人见表1。表1姓名单位职务/职称参与编制标准分工情况蒙泳广西壮族自治区产品质量检验研究院长/高级工程师项目统筹、条款编制和审核黄韵霖广西壮族自治区产品质量检验研究高级工程师技术研发、标准编制陈佳怡广西壮族自治区产品质量检验研究工程师方法开发、标准编制吕仕军广西壮族自治区产品质量检验研究部长/高级工程师项目筹划和实施、条款编制和研究曹轶群广西壮族自治区产品质量检验研究所长助理/高级工程师项目调研缪璐广西壮族自治区产品质量检验研究部长/高级工程师项目调研范云燕南宁市疾病预防控制中心副科长/主任技师项目调研吴家彬广西壮族自治区产品质量检验研究高级工程师方法开发黄俊翔广西皇氏乳业有限公司总经理/工程师项目调研何善廉广西壮族自治区产品质量检验研究副所长/高级工程师标准编制熊碧玉广西壮族自治区产品质量检验研究工程师标准编制陆莉莉广西壮族自治区产品质量检验研究副所长/高级工程师标准编制欧阳小艳南宁市疾病预防控制中心高级工程师标准编制黄珊南宁市疾病预防控制中心副主任技师标准编制杨剑广西壮族自治区产品质量检验研究工程师方法验证容崎康广西壮族自治区产品质量检验研究工程师方法验证雷向容广西壮族自治区产品质量检验研究高级工程师方法验证石爱萍广西皇氏乳业有限公司副总经理/工程师方法推广李雯晓广西皇氏乳业有限公司经理/工程师方法推广张英宁广西壮族自治区产品质量检验研究工程师标准编制彭祖樑广西壮族自治区产品质量检验研究工程师标准编制杨再亮广西壮族自治区产品质量检验研究初级工程师标准编制编制背景及现状、前期研究情况、目的和意义水牛乳因其卓越的营养品质和独特的生物活性成分被公认为“奶中极品”，水牛乳中的总固形物、脂肪、蛋白质等约为普通牛乳的两倍，维生素及矿物质含量显著高于普通牛乳，且富含免疫球蛋白G、类胰岛素生长因子以及具有抗氧化和神经保护功能的神经节苷脂等生物活性成分，营养价值突出。广西长期肩负全国奶水牛杂交选育及水牛乳业发展的重任，在产业规模、科技水平、企业实力等方面均位居全国前列，于水牛科技领域屡创世界第一。2021年，广西奶水牛全产业链产值达50亿元，“十四五”期间预计产值将实现倍增，达到100亿元，生水牛乳产量预计达7万吨。专业机构预测，2025年广西水牛奶综合产值有望突破100亿元，成为推动地方经济发展的新生力量。在此背景下，制定相关检测标准以保障水牛乳质量，对维护当地乳制品质量安全意义重大，不仅有助于提升消费者对广西乳制品的信任度与认可度，更能助力广西乳制品拓展市场，走向东盟乃至全球，有力推动地方经济增长。近年来，随着水牛乳制品市场需求增长，其质量安全问题备受关注。在现代农牧业中，农药与兽药广泛使用于防控病虫害、保障产量，但其残留可通过饲料污染或直接施用在动物组织或乳源中蓄积。与此同时，真菌毒素普遍存在于植物性饲料原料中，可通过食物链以原型及其代谢物形式污染牛乳，严重威胁着水牛乳的食品安全。水牛乳中潜在的真菌毒素、兽药和农药残留物种类繁多，且因其性质和化学结构差异极大，需要多种分析手段协同检测。近年国内外对真菌毒素、农药及兽药残留的研究，侧重于分析食品中的单一类型药物或作用机制相近的药物。但实际食品安全检测中，多种有害残留常并存，现有方法难满足多残留高效检测需求。经深入调研，当前国内在真菌毒素、兽药以及农药残留物的检测标准体系，暴露出显著的单一性弊端。在真菌毒素检测范畴，现行国家标准对乳及乳制品中真菌毒素的限量管控，只集中于黄曲霉M1，而针对脱氧雪腐镰刀菌稀醇、伏马毒素、玉米赤霉烯酮等其他真菌毒素的限量规定相对不足。多数检测手段仅能实现对单一真菌毒素的测定，一次分析流程往往仅针对某一种特定毒素，难以达成对多种真菌毒素的同步检测。样品前处理环节，免疫亲合柱净化技术虽具备较高选择性，但因其高昂的成本，以及仅能适配特定类别毒素检测的特性，在面对复杂多样的真菌毒素检测需求时，显得捉襟见肘，无法满足对不同类别多种毒素的高效检测要求。兽药检测领域同样面临困境，由于兽药种类繁多，现有的检测标准多聚焦于单一类别或作用机制相近的药物。以抗生素类兽药为例，标准多围绕喹诺酮类、磺胺类等某一类抗生素，分别制定检测方法与限量标准。然而，实际养殖过程中，动物体内可能同时残留多种不同类别的兽药，除抗生素外，还可能存在激素类、驱虫类兽药等，此时却缺乏一套能够同时检测多种类别兽药的综合性标准。值得注意的是，三氯苯达唑（抗吸虫和抗球虫药物）、加米霉素（第二代大环内酯类兽用抗生素），至今尚无对应的食品检测标准。目前，国内尚未构建起一套成熟且权威的标准体系，能够在同一检测流程中，对多种真菌毒素、兽药、农药残留量进行精准、高效的同时检测。这一现状严重制约了对水牛乳产品质量安全的全面把控，亟待通过制定全新的团体标准予以改善。建立针对水牛乳中这56种危害物多残留的检测方法，对保障水牛乳食用安全、稳固当地水牛乳产品质量安全防线以及维护和提升本地水牛乳品牌形象均具有不可估量的重要意义。此检测方法操作简便，实验结果稳定可靠，能够为监管部门提供强有力的技术支撑，助力其更高效地开展监管工作。本文件的制订与实施，高度契合水牛乳产业迅猛发展的趋势。高通量精准分析技术的成功建立，不仅大幅提高了分析效率，还能系统、全面地识别水牛乳中的多残留物质，最大程度减少检测盲点，为水牛乳行业提供了一套科学、实用的技术解决方案，推动整个行业朝着规范化、标准化方向迈进，助力水牛乳产业健康发展，提升本地水牛乳品牌形象。标准编制过程1、成立编制工作组项目组前期依托桂科计字【2022】68号文件下达的广西创新驱动发展专项资金项目“广西奶水牛‘十万百亿’重大技术攻关与产业化示范”（合同编号：桂科AA22068099）所属课题《水牛乳及其制品质量安全检测关键技术研发》，该课题的任务之一是制定相关的团体标准。团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》项目任务下达后，课题组及相关参与单位组成工作组，就团体标准开展调研、试验、比对、编制等相关工作。由广西壮族自治区产品质量检验研究院牵头组织成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作，具体由南宁市疾控中心、广西皇氏乳业有限公司等单位相关人员配合。2、展开调研，收集资料编制工作启动后，编制工作组广泛收集和学习与本文件编制相关的资料，标准编制工作组收集了国内有关食品中真菌毒素、兽药、农药及其代谢物检测以及水牛乳相关文献资料。主要有：GB5009.22-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定GB5009.24-2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定GB5009.111-2016食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定GB5009.118-2016食品安全国家标准食品中T-2毒素的测定GB5009.209-2016食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定GB5009.240-2023食品安全国家标准食品中伏马菌素的测定GB/T21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法GB/T21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法GB/T21314-2007动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法GB/T22972-2008牛奶和奶粉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T22978-2008牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T23211-2008牛奶和奶粉中493种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测T/GXAS384-2022广西水牛乳研讨确定主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为液相色谱-质谱联用法测定水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留的检测原理、试剂和材料、仪器设备、试样制备与保存、分析步骤、结果计算、精密度、检出限和定量限、回收率。调研、形成草案、征求意见稿2025年1月～3月，标准编制工作组通过调研广西水牛乳产区及有代表性的广西皇氏乳业有限公司，考察企业水牛乳生产情况及类型，确定检测基质类型。经过企业调研、资料查询了解水牛乳中常见的真菌毒素、农药、兽药种类及其限量要求，确认多残留检测方法的56种目标分析物，进行方法开发和优化，完成团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》（草案）。2025年3月～10月，标准编制工作组对建立的方法进行系统的方法验证，分别采集五个奶水牛养殖场（皇氏集团横县摩拉菲尔奶水牛场、北流市仕利奶水牛养殖场、上思皇氏乳业畜牧发展有限公司、龙州甘牛乳业有限公司、腾冲市巴福乐槟榔江水牛良种繁育有限公司）的30份鲜水牛乳，以及随机抽取的26份市售水牛乳制品，采用本方法进行检测，验证了方法的可行性。并邀请相关检测单位进行方法验证，根据验证结果和意见进行多次讨论修改形成团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》（征求意见稿）和编制说明。标准编制原则1、规范性原则标准的编写格式按GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》中的规定进行编写。2、实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留的检测方法当前现状，结合现有检测基础，通过方法开发和优化结果总结起草的，建立的方法简单快速，实用性强，符合相关检测标准的要求，方法的建立有利于提高广西水牛乳质量和商品经济价值，提高人民经济效益，对推动广西水牛乳产业健康发展，维护当地乳制品品牌形象，具有较强的实用性和可操作性。3、协调性原则本文件编写过程中注意了与水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。4、科学性原则本文件是在实验基础上，按照标准方法开发的相关要求建立的方法，形成草案，并经过多方方法验证，秉承科学严谨的实验原则，建立的方法可靠性强，适应性广。主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的论据团体标准《水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留检测方法液相色谱-串联质谱法》主要内容包括原理、试剂和材料、仪器设备、试样制备与保存、分析步骤、结果计算、精密度、检出限和定量限、回收率。（一）范围本文件规定了水牛乳中真菌毒素残留量（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3），兽药残留量（恩诺沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶、地塞米松、阿苯达唑、三氯苯达唑、加米霉素、氟尼辛葡甲胺、头孢噻呋），农药及其代谢物残留量（倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亚砜、除虫脲、敌百虫、敌敌畏、毒死蜱、对硫磷、多菌灵、甲胺磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲基异柳磷、甲萘威、甲霜灵、久效磷、克百威、3-羟基克百威、喹硫磷、乐果、马拉硫磷、咪鲜胺、灭线磷、三唑磷、三唑酮、水胺硫磷、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、戊唑醇、辛硫磷、乙酰甲胺磷）的液相色谱-串联质谱检测方法。本文件适用于水牛乳中黄曲霉毒素B1等56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物多残留的检测，其它同类食品可参照执行。（二）规范性引用文件依据正文中规范性采纳的标准列出规范性引用文件，排列顺序符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求。（三）原理根据食品中前处理的一般步骤分为提取和净化两个步骤，本方法采用的是2%甲酸乙腈溶液作为提取液，提取过程中加入盐析剂，能促使乙腈与水层实现良好分离，同时起到分散基质、促进蛋白质沉降、降低极性共提物的作用，无水硫酸镁可除去体系中的水分。水牛乳富含脂肪、蛋白质等，基质复杂，经乙腈提取沉淀后，提取液中还存在多种杂质，还需进行进一步的净化，去除对目标分析物检测的干扰，最后上机检测。提取液经氯化钠盐析分层和硫酸镁脱水，用吸附剂C18进行净化，因此确定试样中的原理为：试样用乙腈提取，提取液经分散固相萃取净化，液相色谱-质谱联用仪检测，外标法定量。（四）试剂及其配制根据标准GB/T6682，本实验用水均需符合GB/T6682中规定的一级水。按照色谱上机的要求，本实验所有试剂均为分析纯或者色谱纯；此外根据本实验的方法优化结果最终确定试剂以及配制步骤如下：试剂和材料乙腈（CH3CN）：色谱纯。甲醇（CH3OH）：色谱纯。甲酸（HCOOH）：色谱纯。氯化钠（NaCl）。无水硫酸镁（MgSO4）。溶液配制30%乙腈溶液：取乙腈300mL、水700mL，混匀。2%甲酸乙腈溶液：量取20mL甲酸加入980mL乙腈中，混匀。0.1%甲酸溶液：取甲酸溶液1.0mL，加水溶解并稀释至1000mL。乙腈-0.1%甲酸溶液：取乙腈75mL、0.1%甲酸溶液25mL，混匀。标准品56种真菌毒素、兽药、农药标准物质纯度均为经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。标准物质英文名称及CAS号参见附录A。标准溶液配制真菌毒素标准储备溶液（100mg/L）：分别称取适量（精确至0.1mg）真菌毒素标准品，用乙腈溶解，-18℃以下避光保存，有效期半年。兽药标准储备溶液（1000mg/L）：称取适量（精确至0.1mg）头孢噻呋标准品，用30%乙腈溶液溶解，-18℃以下避光保存，有效期半年；分别称取适量（精确至0.1mg）其余兽药标准品，用甲醇溶解，-18℃以下避光保存，有效期半年。农药及代谢物标准储备溶液（1000mg/L）：分别称取适量（精确至0.1mg）农药及代谢物标准品，用乙腈溶解，-18℃以下避光保存，有效期1年。真菌毒素混合标准中间液：分别准确移取适量的真菌毒素标准储备溶液逐级稀释至同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，其中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2浓度为125ng/mL，黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2浓度为100ng/mL，T-2毒素浓度为1000ng/mL，脱氧雪腐镰刀菌稀醇浓度为20000ng/mL，玉米赤霉烯酮浓度为5000ng/mL，伏马毒素B1浓度为3000ng/mL，伏马毒素B2、伏马毒素B3浓度为1500ng/mL，-18℃以下避光保存，有效期1个月。兽药混合标准中间液：分别准确移取适量的兽药标准储备溶液逐级稀释至同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，其中恩诺沙星、环丙沙星、磺胺嘧啶、地塞米松、加米霉素浓度为1000ng/mL，阿苯达唑浓度为400ng/mL，三氯苯达唑浓度为500ng/mL，氟尼辛葡甲胺浓度为100ng/mL，头孢噻呋浓度为4000ng/mL，-18℃以下避光保存，有效期1个月。农药及代谢物混合标准中间液（10mg/L）：分别准确移取乙酰甲胺磷标准储备溶液1000μL、其余农药及代谢物标准储备溶液各100μL至同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-18℃以下避光保存，有效期1个月。真菌毒素、兽药、农药及其代谢物混合标准工作液：分别准确移取真菌毒素混合标准中间液1.0mL、兽药混合标准中间液1.0mL、农药及代谢物混合标准中间液100μL至同一10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，现配现用。（五）仪器设备查阅相关国家标准及国内外文献，采用液质联用技术测定56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物，既免去了繁琐的衍生化前处理过程，只需萃取富集，又具备较高的灵敏度；本方法需要称标品、称样、涡旋混匀、超声混匀、高速离心、过滤、以及配制曲线等步骤，最终确定基本的仪器设备如下：液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI源）。分析天平：感量0.01g和0.0001g。高速冷冻离心机：4℃、10000r/min。涡旋混合器。超声波清洗器。氮吹仪。移液器：10μL，100μL，1000μL，10.0mL。微孔滤膜：0.22μm，有机相。聚丙烯离心管：15mL，50mL。（六）试样制备与保存试样制备与保存的确定主要是参照相关标准如GB/T22972-2008《牛奶和奶粉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留量的测定液相色谱-串联质谱法》、GB/T22978-2008《牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定液相色谱-串联质谱法》、GB/T23211-2008《牛奶和奶粉中493种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中对牛奶样品的样品制备与保存步骤。（七）分析步骤1.提取本方法采用QuEChERS法作为前处理方法，QuEChERS法可大幅减少了有机溶剂的使用量，且能够从复杂的食品基质中高效、经济且快速地提取目标化合物，在农药残留测定领域应用极为广泛，适合不同极性化合物的多类别残留组分同时检测。QuEChERS法通常使用乙腈提取体系，在提取液中加入适量的甲酸，能够更有效地提取对酸度和极性较为敏感的弱碱性分析物，还能降低牛乳的基质效应。因此在乙腈中分别加入0.1%、0.5%、1%、2%、4%、6%不同比例的甲酸，考察对目标分析物的提取回收率的影响。结果如图1所示，大部分真菌毒素的回收率随着甲酸浓度增加呈递增趋势，伏马毒素在不加酸时回收率趋近于零。对于兽药，恩诺沙星、环丙沙星、头孢噻呋的回收率随着甲酸浓度增加而升高，而磺胺嘧啶、三氯苯达唑的回收率随着甲酸浓度增加而降低，其余兽药的回收率受甲酸浓度影响无显著差异。对于农药及其代谢物，不同浓度的酸化乙腈对其提取效果差异亦不明显，表明该类物质对酸度变化的敏感性较低。综合考虑，当甲酸浓度为2%时，56种目标分析物的回收率均超过70%，处于73.7%～104.3%区间，满足多残留检测方法的验证要求。因此，选择2%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂，可实现水牛乳中真菌毒素、兽药、农药的高效同步提取。图1不同提取溶剂对部分真菌毒素、兽药、农药及其代谢物回收率的影响2.净化QuEChERS法中常用C18、PSA、GCB等作为净化吸附剂，并加入无水硫酸镁去除体系中残余的水分。C18可有效去除脂肪和蛋白质、矿物质等非极性杂质，PSA常用于去除糖类、脂肪酸和有机酸等极性杂质。GCB主要用于去除色素和甾醇类杂质，但往往会同时吸附大多数强极性及中等极性化合物，有研究表明GCB对喹诺酮类兽药有较强吸附作用。因此本研究选取C18、PSA以及无水硫酸镁为净化剂，仅添加其中一种（每毫升提取液分别使用150mg无水硫酸镁、50mgC18、50mgPSA）于定量提取液中进行净化。实验结果表明PSA对伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、头孢噻呋有较强的吸附作用，导致伏马毒素无法回收，头孢噻呋回收率低于60%，这可能是由于PSA的乙二胺-N-丙基官能团易与酸性真菌毒素分子上的羧基反应，头孢噻呋作为酸性物质（pKa值为2.68）也易与其发生相互作用。加入无水硫酸镁后，伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3、加米霉素、恩诺沙星、环丙沙星回收率低于60%；而C18未发现明显的吸附现象，还降低了真菌毒素在牛乳中的基质效应，因此本研究选用C18作为后续优化的净化吸附剂。进一步对净化剂的用量进行考察，当每毫升提取液使用60mgC18，各目标分析物的回收率和净化效果最优。图2不同净化剂对56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物回收率的影响提取过程中加入盐析剂，能促使乙腈与水层实现良好分离，同时起到分散基质、促进蛋白质沉降、降低极性共提物的作用，无水硫酸镁或无水硫酸钠可除去体系中的水分。分别加入1g氯化钠、1g氯化钠+4g无水硫酸镁、1g氯化钠+4g无水硫酸钠作为盐析剂组合考察对目标分析物的提取回收率的影响。结果表明，后两种组合的盐析剂均能促使两相分层并有效除水，如图2所示使用1g氯化钠或1g氯化钠+4g无水硫酸钠时，有部分目标分析物（伏马毒素类）回收率低于60%；当使用1g氯化钠+4g无水硫酸钠时，存在较强的基质增强效应，有22种农药的回收率大于120%；当使用1g氯化钠+4g无水硫酸镁时，56种目标分析物回收率均处于70%～120%范围内，因此选择1g氯化钠+4g无水硫酸镁作为盐析剂组合。图3不同盐析剂对56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物回收率的影响3.复溶液的筛选以50%乙腈水溶液和75%乙腈水溶液作为复溶液，并分别加入0.1%、0.5%和1%的甲酸，考察对56种真菌毒素、兽药和农药及其代谢物回收率的影响。结果表明当使用50%乙腈水溶液时，环丙沙星、多菌灵、甲胺磷、乙酰甲胺磷出现色谱峰展宽或分裂的现象，使用75%乙腈水溶液时峰形良好。复溶液中加入甲酸后，多数目标物的质谱响应增强，其中甲酸浓度为0.1%时响应最优，继续增加甲酸浓度至0.5%、1%时，可能由于分子离子峰[M+H]+稳定性下降，响应略有降低。因此选择75%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）作为样品复溶液，以确保峰形稳定性与检测灵敏度。图4不同复溶液对环丙沙星峰形及灵敏度的影响4.基质匹配标准曲线的制备由样品基质中的共同提取物造成目标分析物在离子化反应中发生的离子抑制或增强的现象称为基质效应（matrixeffect，ME），其计算公式为ME（%）=（基质匹配标准溶液曲线斜率/溶剂标准溶液曲线斜率‒1）×100%。当ME为正值时表示基质增强，反之则为基质抑制，绝对值越大则表示基质效应越强。当ME在-20%～20%为弱基质效应，ME为-50%～-20%、20%～50%为中等基质效应，ME小于-50%或大于50%为强基质效应。在本研究中，观察到了水牛乳基质对不同目标分析物的抑制和增强现象（图3）。有47种化合物的基质效应在-18.4%（涕灭威亚砜）至16.6%（T-2毒素）之间，表现为弱基质效应；2种化合物具有中等基质增强效应，ME分别为21.0%（黄曲霉毒素M1）和23.0%（3-羟基克百威）；7种化合物具有中等基质抑制现象，分别为玉米赤霉烯酮、倍硫磷、毒死蜱、对硫磷、甲胺磷、甲基毒死蜱、辛硫磷，ME在-39.0%（毒死蜱）至-20.2%（对硫磷）之间。为了降低成本，增加方法的普适性，本研究使用水牛乳空白基质溶液配置标准曲线以降低基质效应。图5水牛乳中56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物回收率的基质效应基质匹配标准曲线配置过程为：精密量取真菌毒素、兽药、农药及其代谢物混合标准工作液0μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL，分别加入8份经提取和净化的空白试样提取液中，40℃氮气吹干，用1.0mL乙腈-0.1%甲酸溶液复溶，配制成基质匹配系列混合标准溶液，微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱仪测定。以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。测定（1）液相色谱参考条件本研究的多数目标分析物采用ESI+模式进行检测，加入甲酸可以有效改善峰形，提高离子化效率，增强响应。对乙腈/水和乙腈/0.1%甲酸水作为流动相的效果进行比较，采用乙腈/0.1%甲酸水作为流动相时，56种化合物的峰形、分离度及响应均优于乙腈/水体系。进一步优化流动相梯度洗脱条件，使同分异构体伏马毒素B2、伏马毒素B3实现基线分离，在15min内完成56种目标分析物的高效分离并使其出峰时间尽量均匀分布。为了在尽可能短的分离时间内提高56种目标分析物的灵敏度，本研究采用动态多反应监测方式（ScheduledMRM）对分析物进行分段扫描。动态多反应监测仅在监测离子对设定的保留时间窗口内采集目标组分信号，仪器对各个目标分析物采集时间窗口进行动态分配，可以有效减少同时采集的离子对数目，提高了目标分析物的响应，增强检测的灵敏度，提高分析效率。最终优化的梯度洗脱条件如下：色谱柱：ThermoAcclaimC18，2.2μm，2.1mm×100mm，或相当者；流动相：A为乙腈；B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1；柱温：40℃；进样量：2μL。表1梯度洗脱程序时间/min流速/（mL/min）A/%B/%00.3595100.39010120.3901012.50.3595150.3595（2）质谱参考条件采用针泵恒流进样模式，将约0.5μg/ml的各个目标分析物单标溶液逐一注入质谱仪，在正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下进行一级质谱扫描，以确定合适电离方式。多数目标分析物在正离子模式下离子强度更高，易形成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+等正离子；玉米赤霉烯酮和地塞米松则在负离子模式下灵敏度较高，易失去质子生成带负电荷的离子[M-H]−。因此，实验选定正、负离子两种模式。对选定的母离子施加碰撞能量，进行ProductIon（MS2）扫描获取二级子离子，挑选2个响应优、干扰少的子离子与其母离子组成监测离子对。再采用多反应监测模式（MRM）优化各监测离子对的碰撞电压（CE）和去簇电压（DP），建立目标分析物质谱方法如下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正、负离子模式；检测方式：多反应监测；离子喷雾电压：4500V（ESI+)、-4500V（ESI-)；离子源温度：500℃；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：8.0psi；喷雾气压力：55psi；辅助加热气压力：55psi；表256种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物的监测离子对参数编号名称保留时间(min)母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压（V）碰撞电压(eV)扫描模式1黄曲霉毒素B17.51313.1241.1*/2855647/25+2黄曲霉毒素B27.18315.1259.1*/287.26139/293黄曲霉毒素G17.20329243.0*/3115131/254黄曲霉毒素G26.87331.1245.1*/3135641/275黄曲霉毒素M16.48329.1273.3*/259.216032/366黄曲霉毒素M26.17331.1273.1*/259.116033/347T-2毒素8.85489.2245.2*/327.23835/338脱氧雪腐镰刀菌稀醇4.34297.3249.2*/203.112014/209玉米赤霉烯酮9.38317.2175.1*/131-168-34/-3710伏马毒素B16.66722.5352.5*/334.44547/5411伏马毒素B27.07706.5336.5*/354.54248/4312伏马毒素B37.30706.5336.6*/354.64248/4313恩诺沙星5.17360316.0*/24510526/3714环丙沙星4.95332314.0*/23110027/5015磺胺嘧啶4.44251156.0*/1088020/2916地塞米松7.55437.2361.2*/307.1-70-23/-4417阿苯达唑7.09266.3234.1*/1914027/4518三氯苯达唑10.52358.9344.1*/274.118038/5019加米霉素5.77777.6619.6*/158.24042/4820氟尼辛葡甲胺8.94296.9279.1*/264.115032/4421头孢噻呋6.56524.2241.1*/2106023/3022倍硫磷10.94279.1169.0*/2477823/1823倍硫磷砜8.85311124.8*/278.910025/2324倍硫磷亚砜7.85295280.0*/1099025/4525除虫脲10.10311158.0*/1414520/4926敌百虫5.55256.9109.0*/2216521/1627敌敌畏7.51221109.0*/1277023/2728毒死蜱12.35349.9197.9*/977528/4529对硫磷10.85292236.0*/2647320/1530多菌灵4.27192.1160.1*/132.18025/4131甲胺磷2.6314294.0*/1255719/1832甲拌磷11.3726175.0*/475121/5333甲拌磷砜9.2029397.0*/1156550/3534甲拌磷亚砜8.10277199.0*/1532513/1935甲基毒死蜱11.41321.9125.1*/125.16528/2836甲基嘧啶磷11.13306.1164.1*/108.19029/4037甲基异柳磷11.05332.1121.0*/2312043/1938甲萘威8.22202.1145.1*/127.15615/4039甲霜灵8.31280.2220.1*/192.17518/2440久效磷4.80224.198.1*/1276017/2141克百威7.89222.1165.1*/1237016/29423-羟基克百威5.83238.1181.1*/163.17016/1843喹硫磷10.75299.1163.0*/147.17731/2944乐果6.21230199.0*/1255613/2945马拉硫磷10.14331127.0*/997016/3246咪鲜胺9.22376.2308.0*/2662015/2247灭线磷9.82243.197.0*/130.96743/2648三唑磷10.19314.1162.1*/119.18024/5049三唑酮9.72294.1197.1*/225.17021/1750水胺硫磷11.05231121.0*/10910026/3851涕灭威7.01208.1116.1*/892011/2552涕灭威砜4.66240.1148.0*/166.13017/1653涕灭威亚砜4.03207.1132.0*/89559/2054戊唑醇9.89308.270.0*/1259549/4755辛硫磷11.24299.1129.0*/1535518/1056乙酰甲胺磷3.30184143.0*/1255012/253.定量测定在优化的仪器条件下，选取不含目标分析物的空白水牛乳样品进行前处理，得到空白基质提取液，添加适量混合标准工作液，制备基质匹配系列标准溶液，采用外标法进行定量分析，以质量浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标拟合线性方程，结果如表3所示。多反应监测(MRM)色谱图如图4所示。表356种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物的线性方程、检出限及定量限化合物线性浓度范围（ng/ml）线性方程Y=bx+a相关系数r检出限(μg/kg)定量限(μg/kg)黄曲霉毒素B10.063~2.5y=25435.1x+574.80.999550.030.09黄曲霉毒素B20.063~2.5y=17795.5x+1958.70.999790.030.09黄曲霉毒素G10.063~2.5y=10940.0x+1147.00.999970.030.09黄曲霉毒素G20.063~2.5y=8498.6x+853.70.999870.030.09黄曲霉毒素M10.05~2.0y=28772.4x+-83.10.999920.0060.02黄曲霉毒素M20.05~2.0y=15556.2x+915.90.999940.0060.02T-2毒素0.5~20y=17991.0x+694.00.998640.10.3脱氧雪腐镰刀菌稀醇10~400y=733.9x+1686.60.999661.24.0玉米赤霉烯酮2.5~100y=568.1x+20.70.999713伏马毒素B11.5~60y=4162.9x+611.50.9995713伏马毒素B20.75~30y=10867.2x+1113.20.9996713伏马毒素B30.75~30y=9042.5x+574.30.9986213恩诺沙星0.5~20y=23375.9x+2888.20.99990.20.6环丙沙星0.5~20y=12448.2x-1038.70.999620.20.6磺胺嘧啶0.5~20y=16505x+4495.80.99970.20.6地塞米松0.5~20y=3160.3x+205.40.999880.20.6阿苯达唑0.2~8y=307351x+170360.999610.20.6三氯苯达唑0.25~10y=86688.6x+144670.998750.20.6加米霉素0.5~20y=18621.7x-3259.70.999260.20.6氟尼辛葡甲胺0.05~2.0y=265471x+7001.90.999750.10.3头孢噻呋2~80y=15602x+-2586.30.999950.270.8倍硫磷0.5~20y=12646.0x+208780.998340.060.2倍硫磷砜0.5~20y=8510.0x+2623.10.998730.060.2倍硫磷亚砜0.5~20y=105926x+19485.10.99970.060.2除虫脲0.5~20y=53895x+1853390.999640.060.2敌百虫0.5~20y=40036.2x+8503.30.998050.060.2敌敌畏0.5~20y=36701.4x+271450.999810.060.2毒死蜱0.5~20y=9180.8x+2813.80.998210.060.2对硫磷0.5~20y=2822.5x+2060.90.998940.060.2多菌灵0.5~20y=217014x+37545.70.999490.060.2甲胺磷0.5~20y=25253.7x+3023.20.999380.060.2甲拌磷0.5~20y=11968.6x+456.30.999710.060.2甲拌磷砜0.5~20y=36994.9x+100020.999640.060.2甲拌磷亚砜0.5~20y=120243x+30305.60.99950.060.2甲基毒死蜱0.5~20y=11593.3x+7401.60.997950.060.2甲基嘧啶磷0.5~20y=510679x+56300.70.999020.060.2甲基异柳磷0.5~20y=138100x+150310.999870.060.2甲萘威0.5~20y=55960.9x+22623.90.999550.060.2甲霜灵0.5~20y=308197x+76352.30.99960.060.2久效磷0.5~20y=48408.8x+15266.80.999830.060.2克百威0.5~20y=182625x+35974.40.999770.060.23-羟基克百威0.5~20y=38538.2x+11114.40.999820.060.2喹硫磷0.5~20y=159852x+32279.60.998690.060.2乐果0.5~20y=70532.0x+22314.90.999470.060.2马拉硫磷0.5~20y=137289x+6451.60.997690.060.2咪鲜胺0.5~20y=87714.0x+24739.90.998560.060.2灭线磷0.5~20y=204679x+45508.80.999710.060.2三唑磷0.5~20y=617467x+1273210.999510.060.2三唑酮0.5~20y=116120x+25828.30.999250.060.2水胺硫磷0.5~20y=311431x+574190.999530.060.2涕灭威0.5~20y=26291.7x+2561.10.999680.060.2涕灭威砜0.5~20y=10337.3x+10629.70.999690.060.2涕灭威亚砜0.5~20y=21243.4x+5834.30.999780.060.2戊唑醇0.5~20y=267025x+354220.999810.060.2辛硫磷0.5~20y=19412.6x+10320.10.999370.060.2乙酰甲胺磷5~200y=12634.5x+32085.50.999860.62.0AflatoxinB1(313.1/241.1)AflatoxinB1(313.1/241.1)图656种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物的多反应监测(MRM)色谱图8.结果计算结果计算和表述参照GB5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》、GB/T23211-2008《牛奶和奶粉中493种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》中的计算的表述。9.精密度精密度的描述是按照GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中对痕量分析中的要求确定的，以相对标准偏差（RSD）表示，结果参见表4。10.其他（1）检出限和定量限分别向空白水牛乳样品基质添加目标分析物，以3倍和10倍信噪比确定方法的检出限和定量限，结果如表3所示。本方法所有目标分析的定量限均低于国家限量要求。（2）回收率采用阴性空白水牛乳样品进行回收率和精密度试验，分别进行低、中、高3个添加水平的加标回收验，每个浓度设置6个平行试验，回收率和精密度结果见表4，满足实验室质量控制规范GB/T27404-2008的要求。表4在不同加标水平下56种真菌毒素、兽药、农药及其代谢物的加标回收率和精密度（n=6）化合物添加浓度(μg/kg)回收率(%)相对标准偏差RSD(%)基质效应ME(%)黄曲霉毒素B10.03，0.15，0.2583.8，86.9，109.16.4，2.3，3.311.5黄曲霉毒素B20.03，0.15，0.2579.6，83.9，107.33.6，2.8，6.0-12.0黄曲霉毒素G10.03，0.15，0.2582.2，84.1，106.26.3，5.3，6.5-3.8黄曲霉毒素G20.03，0.15，0.2577.8，72.9，100.45.5，7.9，5.612.9黄曲霉毒素M10.02，0.12，0.2087.7，87.7，112.13.1，3.7，2.221.0黄曲霉毒素M20.02，0.12，0.2082.4，80.4，107.93.6，4.7，2.810.5T-2毒素0.2，1.2，292.0，90.9，110.11.1，2.7，4.516.6脱氧雪腐镰刀菌稀醇4，24，4093.2，93.4，113.72.0，4.9，3.5-12.4玉米赤霉烯酮1，6，1082.3，88.0，103.48.1，2.3，3.0-23.6伏马毒素B10.6，3.6，685.7，84.1，100.06.3，4.5，2.3-4.7伏马毒素B20.3，1.8，390.4，85.1，100.07.3，3.5，2.9-4.9伏马毒素B30.3，1.8，388.0，85.0，102.75.7，3.9，4.5-5.7恩诺沙星0.2，1.2，291.8，89.1，105.63.2，1.0，1.7-9.2环丙沙星0.2，1.2，294.6，83.9，107.32.9，3.2，3.42.8磺胺嘧啶0.2，2，577.0，100.4，88.16.8，4.0，2.5-6.3地塞米松0.2，1.2，585.4，103.8，104.33.2，6.3，2.7-14.4阿苯达唑0.08，0.8，288.1，107.3，95.85.6，2.0，1.4-1.8三氯苯达唑0.1，1，2.572.9，107.5，93.46.0，1.6，2.36.3加米霉素0.2，2，587.6，90.6，74.02.8，2.3，2.5-9.4氟尼辛葡甲胺0.02，0.2，0.580.2，107.0，91.26.5，2.4，1.64.0头孢噻呋0.8，8，2094.9，106.0，84.42.6，1.0，1.42.0倍硫磷0.2，1.2，571.2，70.5，85.35.4，7.0，8.0-25.7倍硫磷砜0.2，1.2，579.0，103.1，99.15.9，3.9，2.4-6.7倍硫磷亚砜0.2，1.2，594.2，110.8，102.32.7，1.4，1.41.7除虫脲0.2，1.2，577.2，86.1，100.612.8，5.5，2.9-16.0敌百虫0.2，1.2，588.6，91.5，94.44.5，4.2，2.5-12.4敌敌畏0.2，1.2，588.7，87.9，95.96.8，5.8，2.6-5.8毒死蜱0.2，1.2，573.9，72.5，75.44.0，4.8，3.1-39.0对硫磷0.2，1.2，578.0，82.1，79.16.2，6.8，6.4-20.2多菌灵0.2，1.2，587.4，95.5，85.71.2，4.7，1.4-12.6甲胺磷0.2，1.2，585.2，101.6，104.26.7，5.1，8.4-27.1甲拌磷0.2，1.2，587.3，82.9，81.85.9，3.4，4.1-18.4甲拌磷砜0.2，1.2，581.1，113.7，102.211.2，4.8，1.31.1甲拌磷亚砜0.2，1.2，592.5，113.8，106.01.7，1.9，1.61.9甲基毒死蜱0.2，1.2，579.1，71.5，79.98.8，3.4，3.6-24.7甲基嘧啶磷0.2，1.2，594.4，95.5，86.72.6，1.6，1.0-7.4甲基异柳磷0.2，1.2，584.7，95.3，87.82.1，2.5，0.8-2.7甲萘威0.2，1.2，586.8，96.3，101.83.1，2.2，1.6-5.4甲霜灵0.2，1.2，590.4，101.5，101.93.2，8.9，1.26.2久效磷0.2，1.2，588.8，117.0，106.85.9，1.4，1.4-4.1克百威0.2，1.2，591.1，94.0，88.73.8，1.4，2.0-1.63-羟基克百威0.2，1.2，589.1，116.6，107.03.3，1.0，0.723.0喹硫磷0.2，1.2，595.2，94.0，88.74.0，1.4，2.0-10.9乐果0.2，1.2，582.4，108.5，103.63.8，5.3，1.5-3.4马拉硫磷0.2，1.2，5102.2，99.9，94.51.2，5.5，2.410.1咪鲜胺0.2，1.2，588.8，100.7，104.16.9，8.5，2.93.6灭线磷0.2，1.2，588.1，96.3，97.83.0，2.8，2.50.9三唑磷0.2，1.2，584.0，93.6，86.52.1，3.3，2.55.0三唑酮0.2，1.2，582.9，103.2，97.92.7，1.5，2.2-8.1水胺硫磷0.2，1.2，582.4，95.7，86.62.4，2.8，1.3-8.2涕灭威0.2，1.2，593.7，112.8，98.36.6，2.8，1.2-4.4涕灭威砜0.2，1.2，593.1，108.2，106.74.0，2.4，3.4-12.4涕灭威亚砜0.2，1.2，586.1，112.4，100.81.0，2.1，1.9-18.4戊唑醇0.2，1.2，595.7，104.5，96.32.5，1.3，1.2-2.0辛硫磷0.2，1.2，589.8，85.1，82.45.1，7.8，3.4-35.3乙酰甲胺磷2，12，5074.8，78.2，94.03.0，3.2，4.0-14.2与有关的现行法律法规和强制性标准的关系在标准的制定过程中严格贯彻国家有关方针、政策、法律法规，严格执行国家标准和行业标准。与相关的各种基础标准相衔接，遵循了政策性和协调统一性的原则。与原标准或其他标准的主要差异和水平对比经查阅，国家标准中适用于牛奶基质的真菌毒素检测方法有GB5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》、GB5009.209-2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、T-2毒素、伏马毒素B1、B2、B3也有相应的食品安全国家标准，但不适用于牛奶基质。国标中真菌毒素检测方法主要有酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和超高效液相色谱串联质谱法等，样品前处理主要采用固相萃取柱、多功能净化柱、免疫亲和柱等净化技术。由于真菌毒素在实际样品中通常含量较低，并且不同真菌毒素的结构差异大、理化性质差异大，导致多数分析方法只能检测单个、单类或少数几种真菌毒素，不能满足批量样品中多种真菌毒素同时高通量检测的需求。国家标准中适用于牛奶基质的兽药检测标准有：GB/T21312-2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱