高三生物学一轮复习讲义78 选择性必修3 第九单元 第55讲　重组DNA技术的基本工具

第55讲重组DNA技术的基本工具1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2．实验：DNA的粗提取与鉴定。考点1重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念二、基因工程的诞生和发展1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间________。2．DNA双螺旋结构的提出和____________的证明。3．中心法则的确立。4．____________的破译。5．基因转移载体的发现。________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。6．________体外重组的实现。7．重组DNA表达实验的成功。8．DNA测序和合成技术的发明。9．________技术的发明。10．______________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。三、重组DNA技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)1．(人教版选择性必修3P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．(人教版选择性必修3P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．DNA连接酶3．载体3．(人教版选择性必修3P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于__________________________________________________________________________________________________________________________。4．(人教版选择性必修3P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。[深化拓展]限制酶的选择要求1．位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。2．酶切要求(1)单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。(2)双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。3．数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。4．特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 ()2．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 ()3．限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4000。 ()4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 ()5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ()我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端、N端添加的限制酶识别序列分别是。(2)经过酶切的重组DNA分子和Ti质粒进行连接时，可选用(填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。(3)在ictB基因表达载体的构建中不宜选用Ti质粒作为载体，原因是。基因工程工具酶的应用1．(链接人教版选择性必修3P71图3-3)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′-G↓GATCC-3′、5′↓GATC-3′、5′-CCC↓GGG-3′。下图表示某DNA片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是()A．若用SmaⅠ完全切割该DNA，则其产物的长度为634bp、896bp、758bpB．若虚线方框内的碱基对被T－A替换，则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段C．若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA，可形成相同的黏性末端D．用SmaⅠ切割DNA产生的片段，不能用E．coliDNA连接酶重新将其连接2．(链接人教版选择性必修3P75拓展应用T2)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是()A．可以避免质粒或者目的基因自身环化B．可以避免目的基因与质粒反向连接C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因D．可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来基因工程载体的应用3．(链接人教版选择性必修3P72图3-4、正文)如图为外源DNA、大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________________(写中文名称)，________________________________________，构成人类的胰岛素基因和质粒的基本骨架。(2)将人的胰岛素基因导入质粒构建基因表达载体时，所需的酶是____________________________________；基因表达载体应具有的基本条件有______________________________(答2点)。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为____________，其作用是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)将剪切后的人胰岛素基因和剪切后的质粒混合进行连接反应，得到重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用________处理，使其能吸收周围的DNA。考点2DNA的粗提取与鉴定一、实验原理二、实验步骤1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。1．(链接人教版选择性必修3P75图示信息)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是()A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNAD．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化2．(链接人教版选择性必修3P74－75探究·实践)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是()A．整个提取过程中可以不使用离心机B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是()A．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶2．(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是()A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNAC．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质3．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是()A．质粒和目的基因都用酶3切割，用