高三生物学一轮复习讲义79 选择性必修3 第九单元 第56讲　基因工程的基本操作程序

第56讲基因工程的基本操作程序1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。考点1基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取1．筛选合适的目的基因(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变______________或获得________________等的基因。主要是指______________的基因。(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知______________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。2．利用PCR获取和扩增目的基因(1)原理：DNA半保留复制。(2)条件①一定的缓冲液、DNA模板、____________、4种脱氧核苷酸和________________。②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。(3)过程(4)PCR产物的鉴定：常采用__________________来鉴定。1．(人教版选择性必修3P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________。二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中____________，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够________和发挥作用。2．基因表达载体的组成3．基因表达载体的构建过程三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定2．(人教版选择性必修3P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有____________________、_____________________。[深化拓展]筛选含有重组质粒的受体细胞的方法1．用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞(1)将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。(2)再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。(3)最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。2．用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 ()2．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 ()3．Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 ()4．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 ()1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。(1)第1组：。(2)第2组：。2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。。PCR技术及应用1．(链接人教版选择性必修3P78图3-5)某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是()A．利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链B．不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链D．杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物基因工程的操作程序2．(链接人教版选择性必修3P77正文)随着科学技术的发展，获取目的基因的方法越来越多。下列不属于获取目的基因的方法的是()A．通过PCR技术扩增B．从基因文库中获取C．利用DNA连接酶复制D．利用DNA合成仪通过化学方法人工合成3．(链接人教版选择性必修3P80正文及图3-6)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法：In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是()A．推测In-Fusion酶的作用仅为识别同源序列、连接磷酸二酯键B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化C．形成重组质粒时，如果温度远高于50℃，黏性末端的碱基不容易互补配对D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒任意同源序列4．(链接人教版选择性必修3P81资料卡)铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。某科研团队研究发现，铝胁迫可诱导铝耐受型大豆根尖SGF14a基因的表达。为了验证SGF14a基因在植物应答铝胁迫中的作用，研究人员构建含SGF14a基因的表达载体，将其转化到烟草细胞进而获得转基因烟草，并对转基因烟草进行铝耐受性的研究，具体操作流程如图1所示。回答下列问题：(1)提取铝耐受型大豆根尖细胞中的RNA，在____________的催化下合成cDNA，最终获得SGF14a基因。根据SGF14a基因的核苷酸序列设计相应的引物进行PCR扩增，设计引物时，常在两条引物中加入不同的限制酶酶切位点，其主要目的是______________________________________________________________。已知图1中大豆SGF14a基因的A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的位置，选用的引物组合应为__________________。(2)将表达载体导入经处理的农杆菌后，筛选出含SGF14a基因的农杆菌，然后将其与烟草细胞共培养，携带SGF14a基因的____________整合到烟草细胞的染色体DNA上，进而获得转基因烟草细胞。(3)将农杆菌转化后的烟草细胞诱导形成的愈伤组织先放在含____________(填抗生素)的生芽培养基中，待生芽后，将芽移到生根培养基中培养，以获得烟草植株，生芽培养基和生根培养基中相关植物激素含量的区别是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)为了探究转基因烟草对铝胁迫的耐受性，用50μmol/LAlCl3处理含有SGF14a基因的两个转基因烟草株系(S1和S2)和野生型烟草(WT)的无菌苗的根，24h后分析烟草根相对生长量，结果显示转基因烟草根的相对生长量比野生型烟草的高，请结合图2分析其原因可能是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)为验证转基因烟草植株的抗铝毒能力较野生型烟草植株强，实验小组设计实验进行个体生物学水平的鉴定：将_____________________________________栽培到酸性土壤中，其他条件均相同且适宜，一段时间后，观察___________。考点2DNA片段的扩增及电泳鉴定1．PCR原理：利用了________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的______________等有关。4．实验步骤(1)DNA片段的扩增(2)DNA片段的电泳鉴定①根据待分离DNA片段的大小，用______________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在__________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的____________混匀。②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入__________内。④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶________为宜。⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。1．(链接人教版选择性必修3P84－85探究·实践)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是()A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来2．(不定项)(链接人教版选择性必修3P84－85探究·实践)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析正确的是()A．敲除2、3、4片段引起的变异属于基因重组B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNAC．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子D．图2中，3、5、9个体的体内均能检测到PD-11．(不定项)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是()A．上述PCR反应体系中只加入一种引物B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G2．(2023·重庆卷)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是()A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coliDNA连接酶或T4DNA连接酶3．(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是_____________________________________________________________________________________________________________________