（正式版）DB13∕T 2609-2017 《禽流感病毒与新城疫病毒二重R∕T -PCR检测方法》

ICS65.020.30DB13/T2609—2017禽流感病毒与新城疫病毒二重检测方法2017-12-22实施2017-12-22实施IDB13/T2609—2017本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李李丽敏、白云、韩庆安。DB13/T2609—2017本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与新城疫病毒。2缩略语PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)包括LSTRIzolRNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准(100bp),2×TaqMasterMix。在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.1LSTRIzolRNA提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。3.31.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.5溴化乙锭(EB,10ug/μL)或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。工2DB13/T2609—20174仪器设备5样品以灭活的禽流感病毒与新城疫病毒鸡胚培养物或者感染禽组织作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；5.2.2棉拭子采集将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS(配制方法见附录A中A.5)DB13/T2609—20173样品采集后放入塑料袋内密封(一个采集点的样品放一个塑料袋内),于保温箱中加冰，密封24h5.2.5.1棉拭子处理方法5.2.5.2组织的处理方法将所采集的组织至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比(1:5)加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。6.1RNA的提取6.1.2将250μL经过预处理的待检样品(棉拭子或组织)加入750μLTRIzolLSReagent中，振荡2min,室温放置5min。6.1.3加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min,室温放置5min后，4℃条件下12000r/min离心15min。6.1.4吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置15min,4℃条件下12000r/min离心15min。6.1.5小心吸弃上清，加入DEPC处理的75%乙醇700μL～800μL,4℃条件下12000r/min离心5min。6.1.7提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。涡旋混合15s,56℃孵育15mi6.1.8.2加入250μL无水乙醇，涡旋混合15s,室温放置5min。DB13/T2609—201746.1.8.5室温12000r/min离心1min,彻底去除残留的乙醇，在室温静置1～3min彻底晾干离心柱。6.1.8.6将离心柱转入1.5mL离心管中，并向离心柱中央加20μLRNase-freeWater,室温静置PCR扩增条件：94℃预变性3min,94℃变性10s,56℃退火30s,72℃延伸25s,循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准(100bp)。恒压(110V)电泳30min～40min,将电泳好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带，阴性的扩增产物没有预期的目的条带，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp位置出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒核酸检测阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在297bp位置出现特异性的条带，则判定为新城疫果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp和297bp位置均出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在428bp和297bp位置均未出现特异性的条带，依次陈述试验对象、所使用的标准(包括发布或出版年号)、所使用的方法、检测结果与试验时5(规范性附录)相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶A.250×TAE电泳缓冲液称取EDTA18.61g,加灭菌双蒸水至100mL,后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液(50×)A.3溴化乙锭(EB)溶液焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,加灭菌双蒸水至100mL,室温放置6h～8h,121℃±2℃高压灭A.5.1A液(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液):NaH₂PO₄·H₂027.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏A.5.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液):Na₂HPO₄·7H₂053.6g,(或Na₂HPO₄·127H₂071.6g或Na₂HPO₄·2H₂035.6g)先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制：A液14mL,B液36mL,加氯化钠(NaC1)8.5g,DB13/T2609—20176(规范性附录)表B.1规定了引物的浓度和序列。引物名称引物浓度AIV-decFCGTAGACGCTTTGTCCAGAATGCAIV-decRGTCCTCATTGCCTGCACCATCNDV-decFCGAAGAGCCCGTTAGTCAAATCNDV-de