神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与神经系统疾病

干细胞与组织工程

StemcellsandTissueEngineering神经干细胞与神经系统疾病一、基本概念

二、神经干细胞的来源

三、神经干细胞的研究方法

四、神经干细胞的分化与诱导分化

五、神经干细胞与神经系统疾病一、基本概念神经细胞球神经干细胞神经祖细胞神经前体细胞神经上皮干细胞一、基本概念神经细胞球（neurosphere)

1992年Reynolds等首先提出.利用“神经球法”特殊培养技术，从成年小鼠纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖，具有多向分化潜能的细胞群。从而提出神经干细胞的概念。一、基本概念神经干细胞（neuralstemcell,NSC)

1997年Mckay提出：

NSC是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。一、基本概念神经祖细胞（neuralprogenitorcell，NPC)

具有限制性定向发育成某种或某几种细胞潜能的NSC。相对干细胞来讲，其分化能力和自我更新能力受到一定程度的限制，仅具有单向或双向分化潜能。如O-2A祖细胞。O-2A祖细胞具有定向干细胞的特性

在含血清的培养基中能定向分化为2型星形胶质细胞,其胞体较大,从胞体上伸出细长突起,由突起上再发出更为细小的分支,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性。在无血清的化学条件培养基中能定向分化为少突胶质细胞,其胞体较小,突起短而细,相互交织。O4及CNPase抗体标记阳性。一、基本概念一、基本概念神经前体细胞（neuralprecursor

cell)

指发育过程中任何细胞的早期阶段。是一类在发育进程中较其他细胞处于更早阶段的细胞，可统称干细胞和祖细胞。

如少突胶质前体细胞。一、基本概念少突胶质前体细胞（OPC）———贴壁生长是星形胶质细胞前体细胞；也是少突胶质细胞前体细胞。一、基本概念神经上皮干细胞（neuroepithelialstemcell)

神经上皮(干）细胞（neuroepithelium,NEP)干细胞定向诱导分化的NSC胚胎组织分离的NSC

（两种）成年脑组织分离的NSC神经干细胞永生化二、神经干细胞的来源MSC(包括骨髓,脐带血等来源的)ESCiPS骨髓间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞等成体干细胞具有一定跨系、甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的“可塑性”。

干细胞的可塑性（plasticity）胚胎内细胞群分离的NSC种类神经上皮干细胞（FGF依赖神经上皮干细胞）神经球干细胞（EGF依赖神经球干细胞）FGF依赖神经上皮干细胞二、神经干细胞的来源FGF依赖神经上皮干细胞胚胎NSC的发育及来源二、神经干细胞的来源成年脑组织分离的NSC室管膜下区二、神经干细胞的来源成鼠大脑室管膜下区神经干细胞L:溴脱氧尿苷(BrdU)染色;R:TEM观察成年脑组织分离的NSC海马齿状回二、神经干细胞的来源成鼠大脑海马内神经干细胞(绿色荧光)二、神经干细胞的来源神经干细胞永生化三、神经干细胞的研究方法神经干细胞的分离与纯化神经干细胞的培养神经干细胞的鉴定三、神经干细胞的研究方法（一）神经干细胞的分离与纯化1.神经干细胞的分离流式分选法CD133+/CD34-/CD45-免疫磁珠法纯度可达93%以上

原代培养法

2.神经干细胞的纯化

CD133+CD34-CD45-细胞富含神经干细胞但NSC纯化至今尚是未解决的难题

三、神经干细胞的研究方法（二）神经干细胞的培养1.成体组织及胚胎组织NSC的培养

传统培养方法（neurosphere法）及鉴定2.其他来源NSC的培养

ESC诱导FGF2，LIFNestin阳性细胞团倒置相差显微镜下

NeurospheresNeurosphereforNestin

小鼠抗大鼠单克隆抗体

Nestin

；PE-羊抗鼠IgG传统培养方法（neurosphere法）及鉴定NeurosphereforMussashi小鼠抗大鼠单克隆抗体Mussashi；FITC-羊抗鼠IgG；传统培养方法（neurosphere法）及鉴定ESC来源NSC的培养三、神经干细胞的研究方法（三）神经干细胞的鉴定1.NSC及其分化细胞的形态鉴定1)

Nestin2)Musashi13)p752.NSC的功能鉴定1)NSC离子通道鉴定：全细胞膜片钳技术2）NSC的分化潜能鉴定离体研究在体研究神经递质检测：高效液相化学色谱法严格讲，还应进行增殖及分化能力的鉴定才能确定是否NSC神经干细胞的分离培养鉴定生长状态良好的神经球

抗Nestin

免疫荧光染色

neuronGFAP（一）神经干细胞的分化

1.神经干细胞的自然分化四、神经干细胞的分化与诱导分化Fig.3.IdentificationofNSCsandthreemajordifferentiatedcells.A:Brain-derivedneuralspheresstainedagainstnestin

(1∶800).B:GFAP(1∶200)positivecellsrepresentastrocytes(Br-derivedNSCs).C:β-tubulinⅢ(1∶800)positivecellsrepresentneuron(Br-derivedNSCs).D:Rip(1∶50)positivecellsrepresentoligodendrocytes(SC-derivedNSCs).immunofluorescence

cytochemistrystaining.CellnucleiarelabeledwithHoechst33342.Scalebar,50μm.nestinGFAPβ-tubulinⅢRip四、神经干细胞的分化与诱导分化2.神经干细胞的诱导分化

例1.BDNF体外诱导神经干细胞的增殖和分化

例2.IL-1β和GDNF体外诱导鼠胚中脑神经干

细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化

Fig.4NSEexpressionofdifferentiatedcellsin200mgBDNFgrouponthe3rddayafterinductiondetectedbyimmunocytochemistry.×400Fig.5NSEexpressionofdifferentiatedcellsincontrolgrouponthe3rddayafterinductiondetectedbyimmunocytochemistry.×400EFFECTSOFBDNFONTHEPROLIFERATIONANDDIFFERENTIATIONOFNEURALSTEMCELLS例1.200mgBDNFcontrolgroupNSENSEIL-1β和GDNF体外诱导鼠胚中脑神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化1中脑神经干细胞的分离培养2中脑神经干细胞的诱导分化3免疫细胞化学检测4流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞例2..

取妊娠12d（E12）小鼠，断髓处死75%乙醇中浸泡2min超净工作台上，解剖显微镜下分离脑膜，切取中脑组织用PBS洗3次，剪刀剪碎，加入0.25%胰蛋白酶,370C水平摇床消化5min例2.IL-1β和GDNF体外诱导鼠胚中脑神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化中脑神经干细胞的分离培养培养1W含10%胎牛血清的培养基中止消化反应,吹打混匀,1000r/min离心10min去上清，用无血清培养基重悬细胞，200目尼龙网过滤细胞以5×105/ml接种于60mm培养皿中，另添4%B27和bFGF20ng/ml机械分离传代细胞，离心弃上清液，重悬，计数接种

中脑神经干细胞的分离培养图1原代培养3d小鼠中脑神经干细胞球。×100图2原代培养6d小鼠中脑神经干细胞球。×200图1图23d6d

中脑神经干细胞的分离培养取传代培养5～7d的神经球，接种于置有预先经PLL包被盖玻片的24孔培养板中，按分组进行诱导分化。自然分化GDNF诱导IL-1β诱导GDNF诱导+IL-1β诱导诱导10至12d免疫细胞化学鉴定流式细胞术检测中脑神经干细胞的诱导分化

免疫荧光细胞化学检测

待染细胞，PBS洗2次，纯甲醇–2O℃固定20minPBS洗3次1%TritonX-100透化20minPBS洗3次37℃羊血清孵育20min以封闭非特异反应一抗分别为抗nestin

IgG，抗NSE

IgG，抗GFAP

IgG，抗TH

IgG4℃过夜次日加入荧光素TexasRed标记的二抗，37℃孵育1h缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察PBS洗3次免疫荧光细胞化学染色结果图3免疫荧光染色Nestin阳性神经细胞球。×200图4中脑神经干细胞自然分化10d的NSE免疫荧光反应阳性细胞。×400NestinNSE自然分化10d图5中脑神经干细胞自然分化10d的GFAP免疫荧光反应阳性细胞。×400图6中脑神经干细胞血清培养2d，可见细胞向外迁移。×100图7中脑神经干细胞血清培养10d，大部分神经球分化为单细胞。×200图8GDNF诱导分化10d(GDNF组），TH免疫荧光反应阳性神经元。×400GFAPTHGDNF诱导自然分化10dGFAPTHGDNF诱导自然分化10d图9IL-1β诱导分化10d(IL-1β组），TH免疫荧光反应阳性神经元.图10自然分化10d（对照组），TH免疫荧光反应阳性神经元.×400

IL-1β诱导THTH自然分化10d免疫荧光细胞化学染色结果

流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞收集细胞，纯甲醇–2O℃固定，PBS洗3次。1%TritonX-100透化20min，PBS洗3次，加入抗THIgG一抗，4℃过夜，次日PBS洗3次，加入FITC标记的二抗，37℃孵育lh，PBS洗3次，400目尼龙网过滤，制成单细胞悬液，细胞计数，每组细胞总量调整至1×105～106／ml，上机检测荧光标记细胞百分率。图11各组间TH阳性神经元占全部细胞百分比的比较（与对照组相比，*P<0.01）

流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞

（二）神经干细胞分化调控

1.基因调控（内源性因素）2.细胞因子等（外源性因素）1.基因调控（内源性因素）1)Wnt信号系统Wnt3a作用：抑制体外培养神经球的生成。促进神经元和星形胶质细胞的生成。

-Catenins作用：维持神经前体细胞的增殖。

与FGF2-2有协同促进NSC增殖作用2)bHLH基因（碱性螺旋-环-螺旋转录子）是决定神经分化命运的功能基因。

bHLH基因家族中重要的基因：Ngn1,Ngn2,MASH-1

作用：促进干细胞向神经元分化，同时抑制向胶质细胞分化。1.基因调控（内源性因素）3)Notch信号系统作用:与bHLH信号相反，Notch蛋白的作用为抑制干细胞向神经元分化，同时促进向胶质细胞分化。4）NOV基因（肾母细胞瘤过度表达基因）胚胎及成体脑组织中检测到一定量NOVmRNA存在，提示一定的促细胞生长及分化作用。

2.细胞因子等（外源性因素）1)细胞因子：EGF,bFGF；IL-1;LIF.

TGF-超家族:BMP-22）维甲酸3）神经营养因子:NGF家族：

NGF,NT3,BDNF

GDNF

CNTF4）甲状腺激素

例：生物电场对神经干细胞分化的影响5）物理因素神经突起垂直于电场轴平行排列

神经干细胞与脊髓损伤（一）NSCs治疗脊髓损伤的理论基础1.低免疫原性2.自我更新3.多向分化潜能4.良好的组织相容性5.迁移能力6.长期存活及未见致瘤性7.基因治疗的良好载体五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞植与脊髓损伤（二）NSCs移植的细胞来源1.永生化神经干细胞移植2.ESCs及MSCs来源的神经干细胞移植3.胚胎源或成体神经干细胞移植五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤（三）NSCs治疗脊髓损伤的策略1.内源性NSCs的激活:

内源性NSCs受损伤等因素刺激外源性NSCs体内移植(补充丢失的）损伤局部微环境的改善

细胞因子（营养….)4.

细胞移植的时机和移植的途径五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤NSC移植治疗脊髓损伤的可能机制1.替代缺失的神经元2.使损伤的神经轴索再髓鞘化3.促进受损的神经元轴索再生和神经环路重建五、神经干细胞与神经系统疾病研究工作举例1：五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤研究工作举例2：五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤研究工作举例3：五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤

神经干细胞与脊髓损伤（三）NSCs移植治疗脊髓损伤尚需解决的问题如何获取纯化的NSCs？进行NSCs定向分化？决定因素？分化的NSCs是否具有正常神经功能？干细胞植入和注入方法，需建立标准并做效果评价移植入体内的NSCs定向分化问题植入后如何控制免疫排斥反应移植后的NSCs致瘤性的问题（四）NSCs移植治疗脊髓损伤前景展望五、神经干细胞与神经系统疾病

神经干细胞与脊髓损伤（四）NSCs移植治疗脊髓损伤前景展望

胚胎来源的NSCs….

成年大脑的NSCs……内源性NSCs

转基因治疗…..五、神经干细胞与神经系统疾病帕金森病病变主要是由于黑质多巴胺神经元的变性，导致纹状体内多巴胺水平下降而引起一系列的症状。通过向黑质-纹状体系统植入能合成多巴胺的细胞，可以补充纹状体内多巴胺递质而达到治疗的目的。无论药物治疗还是手术治疗等都不能阻止患者的中脑黑质多巴胺能神经元变性，因而都无法真正治疗帕金森病。神经干细胞移植可以克服这些问题。

五、神经干细胞与神经系统疾病神经干细胞与帕金森病神经干细胞移植治疗帕金森病主要方案：１.细胞移植或细胞替代

1)移植未分化神经干细胞(或移植胚胎中脑组织)

2)神经干细胞分化成