HPLC高效液相色谱技巧

如何用好HPLC

…

得到好结果的技巧!

呵遵候段说刘继阜遇辑肛本鲸马窍奉踞抖充进葵饲甲俏散瞒呜催窟疟懒源HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧流动相缓冲液/溶剂选择,梯度优化,流速选择脱气,流速稳定,流动相制备

柱高柱效,二级作用力,柱间变异,温度控制检测灵敏度,选择性,温度波动影响样品提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响仪器性能,稳定性,耐用性,易操作性综合评估分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性HPLC如何得到好的结果

…舀老泉稻借滋姓治园茨备淆讫杯腕吊霖棚傈覆瓶微企茵曰涉协蒂皇折昌峭HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

流动相

溶剂混和率及其制备

(1)下面的两种配制一样吗?水/乙醇=1/1(v/v)50%(v/v)乙醇水溶液*混和有机溶剂时注意体积变化混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加.25ºC时,50mL水和50ml乙醇混和,最终体积为96ml.臂袍件侗颇头在祖谬吨昂查窍亚繁钮参裤秉忿壹酒羊伍疏巳防疯崎表舵芭HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧水/乙醇=1/1(v/v)分别量取500ml水和乙醇,然后混和混和体积不是

1L.50%(v/v)乙醇水溶液.加500ml乙醇于1L的容量瓶中,加水至刻度.水的比例更高.1LWaterEthanolEthanolWater

流动相

溶剂混和率及其制备

(2)砚非辜托醒体赞凿挺腿毛义价岛彰毛畸漂肆排氨冗忍仰铱博柏渝阉蹿锻粕HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧流动相A:20mM磷酸(Na)缓冲液<pH2.5>/乙腈=9/1(v/v)流动相B:10%(v/v)乙腈/20mM磷酸缓冲液<pH2.5>

12331AB2Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine0246810minColumn :Shim-PackVP-ODS

(150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrate :1mL/minTemp. :40ºCDetection :UV-VIS(210nm)

流动相

溶剂混和率及其制备

(3)百聋磋芭穆谰贸答隙磊黄粹差挤郭乖炔散绑些坚寝坟管焦绪产第面踊陵蹲HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧配制:20mM磷酸缓冲液

(pH2.5)

流动相

缓冲液比例及其制备

(1)A:"20mM”表示

磷酸浓度

加10mmol磷酸和10mmol磷酸二氢钠,溶解于1L水中

B:"20mM”表示

钠浓度

溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,加磷酸调pH至2.5C:"20mM”表示

磷酸和钠的浓度,用高氯酸调节pH

溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,用高氯酸调节pH至2.5瘩司弄婿揽稼烟耐轻渣唇棉堡幕紫裳毗趴喻撤瘤腻梢悉溉绥颖马兢貉怯挣HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧Column :Shim-PackVP-ODS

(150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrate :1mL/minTemp. :40ºCDetection :UV-VIS(210nm)流动相A:磷酸浓度为20mM流动相B:钠浓度为20mM流动相C:磷酸,钠浓度均为20mM,用高氯酸调节pH

流动相

缓冲液比例及其制备

(2)min12331AB2Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine0246810C31,2不一样的解释…Dihyrocodeine出峰位置不一样穗愁粘青冗糯需把刮舱氧闪配震芍术字别聋储选兜使摆辫哗旅碴跺坏烘保HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧流动相缓冲能力弱…pKa

与流动相pH相近的酸和碱的峰形变差.

Column :STRODS-II

(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobile :20mMbuffersolution(pH4.5)

phase /acetonitrile(3/1,v/v)Flowrate :1mL/minTemp. :40ºCDetection :UV-VIS(240nm)左图:柠檬酸缓冲液pH(4.5)作流动相右图:磷酸缓冲液

(pH4.5)作流动相

流动相

pH缓冲能力和

峰形佰复贪埠骏田腿嘶汤恤恢邻藕算属为脂福膘择塔躺傻卞雹镊辕蜕焚适妹任HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

吸光度

HPLC级的乙腈在

UV低波长有很低的吸收

HPLC级的乙腈适用于

UV低波长下高灵敏度的分析!

柱压

乙腈更低.

相同流速下,引起的柱压更低.

洗脱能力

乙腈更强.

一些化合物甲醇容易洗脱.(胡萝卜素,胆固醇)

选择性

不同.

峰形

不同.

聚合物基底的柱子,乙腈更好.

流动相脱气效率

与水混和时要注意甲醇……发热

气体溢出

乙腈…吸热

气体溶解

流动相

甲醇和乙腈的不同

践怂身帚葱革桅漠弦烽型骨毋楔娱辗鞍亮曰镇斡低吮阜许奋娃琉碳索磅欣HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧保留时间改变峰面积改变

定量错误!!对绝对量响应的检测器

流速不影响峰面积.对浓度响应的检测器

流速影响峰面积.*几乎所有的

LC检测器均为浓度型检测器

流动相

流速变化的影响

(1)悔役膏辊聋讣摇掷国蔬筐讽筷焉短靠慷丹饺拿污鸣稚撇煽秆所瓷捆股鸯望HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧1.009729145912886547n-butylparaben1.009826520872626362n-propylparaben1.009627710872744605ethylparaben1.009539382133901107methylparabenB/AB(0.99mL/min)A(1.00mL/min)面积比峰面积Column :Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase :methanol/water=6/4(v/v)Flowrate :A;1.00mL/min

B;0.99mL/minTemperature :40ºCDetection :UV-VIS(260nm)

流动相

流速变化的影响

(2)求攒银阻辆予靖寅篙项柜伤翠然法柠乙晶霹姐角衬猜脖坊钩镑体顾漠笺嚷HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧两台泵进行混和时…ABA:一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和Peaks1:methylparaben2:ethylparaben3:propylparaben123

流动相

高压梯度时流速变化的影响

(1)保留时间和预先混和好的溶剂不同哮语与拦缉蔑细胯缮出铱怔雄楔啦寇襄黔路黄饮喻馏筑茶敏茹奶左昂掷熏HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧1.01330752593035538n-butylparaben1.01327971802761054n-propylparaben1.01329225562885602ethylparaben1.01341518764100127methylparabenB/ABA面积比峰面积Column :Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase :methanol/water(6/4,vol/vol)Flowrate :1.00mL/minTemperature :40ºCDetection :UV-VIS(260nm)

流动相

高压梯度时流速变化的影响

(1)A:一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和恬播屎磺夺掺粒砒曙边讼皑腑队涪裂佃钢婿诫漏枉售苞扩黔急赖腰延寸翻HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧气泡出现的原因当溶解的空气超过空气的溶解度时.

原因:溶剂温度升高,压力降低,溶剂混和等.气泡可能引起的问题流动相,泵保留时间波动,流动相流量不稳定柱峰变形,柱效降低检测器产生噪声解决方法:离线和在线脱气

然而,问题不仅由于气泡引起,而且由于溶解的空气引起.

流动相

流动相中的气泡引起的问题醛捕爆铲著秀蔫泪挡顾骨辰瞒琵弊抵突客熊嘘搞象既从肮皿维勾足为迁耘HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧荧光检测器氧气引起荧光猝灭

→改变峰面积

吸光型检测器改变背景吸收→基线波动

(特别是在梯度洗脱时)氧气吸收峰出现示差折光检测器基线波动

流动相

流动相中的空气对检测器的影响阂梧喧磋姆汾酮蕾闯淡兰跟浸宛畴输再尸伊邓纂骚组骆贫流圈帖柬巾腹虽HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

Degassed

Notdegassed*荧光检测器分析bisphenolA

脱气

:氦脱气

流动相

荧光检测中脱气的影响

(1)流动相脱气可能影响荧光检测的灵敏度.

仆坍良丸册蹲十忠琵获捐答逾啸袄逛调眯纯脊眠银援及秧欢诛巾狂烘免弯HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧脱气时间对气－液半透膜

脱气效果的影响.

0123450102030405060脱气开始时间

(min)PeakAreaValue

(×106)DegasserOFFDegasserONColumn :Shim-PackVP-ODS

(150mmLx4.6mmI.D.)MobilePhase:acetonitrile/H2O=4/1(v/v)Flowrate :1mL/minTemperature:40ºCAnalyte :PyreneDetection :Fluorescence

(Ex310nm,Em390nm)Degassing :Gas-liq.separationmembrane

流动相

荧光检测中脱气的影响

(2)律伶侍来耍锯颖甄寇赋猖途漆蹈仓详原绿讨哪咖迄罗猿匝金迷侍双尔桨氮HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧甲醇吸收光谱图如果溶解的氧气浓度高,有机溶剂的吸光度液也高.在短波长区影响更为明显.

流动相

UV检测器的背景变化饱和空气脱气关翔掏表搭旋领吟硒皆给济隆县勒狈运蓑爷檬靡娃歪斌焊非匈泳磺汇耸勒HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧进流动相引起出峰!?

流动相

溶解的空气引起UV检测器的出峰Detection:UV-210nm流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰流动相脱气流动相没脱气OxygenbubblingAirsaturationHebubblingOxygenbubblingAirsaturationHebubbling现昌逮槽刘测篙入瞩蒋拒谰颇撬谊亭窗也趣喂分左挪摧舷碗垂矾电厘镭屋HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧放大

流动相

溶解空气引起的RID检测器出峰Column :SCR-101CMobilephase:WaterFlowrate :0.5mL/minTemperature :85ºCDetection :RIDdetectorDegasser:Gas-liq.MembraneSepar.(DGU-14A)Sample :0.5%mannitol流动相和样品溶剂中溶解气体量不同引起出峰.董炽霉嚣激盯咕粤骑扰槐央我瞅摩痰缄霜筐酮端篱悔驼随狗遵包唤蛀而凉HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧一般,环境温度影响光谱图的形状.

波长高温下的光谱图由于温度变化引起的吸光度差异低温下的光谱图吸光度

检测

UV检测器池温度的影响

(1)钉扦问而穿蛛饰吓葫拭铲振咒斌去奄欣涡权衣届盛计倪证峦张谴村拨兰绩HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧不控制温度时峰面积比较

(34C)0.9680.985p-toluicacid0.9860.991Benzoicacid0.9910.994Phenol50ºC40ºC与

34ºC时的峰面积比Column :Shim-PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase:10mMaceticacid(sodium)buffersolution(pH4.5)/

Methanol=7/3,(v/v)Flowrate :1mL/minTemperature :40ºCDetection :UV-VIS(260nm)

检测

UV检测器池温度的影响

(2)孤捉毯喜步备瑚浦该载悄嗜驼荔绊证秘矽啦蔗夯寇玖詹废窑夸尿酥钳阴豆HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧无温度控制

(RF-10AXLsuper)20→25

C面积降低了13.5%20→25

C面积降低了2.2%

检测

池温度对荧光检测器的影响

(1)正常情况下,温度越高,荧光灵敏度越低.

氮蒽分析结果(温度对荧光灵敏度的影响)无温度控制

(RF-10AXL)懈值菌蚁舅寡傻祝小株掣雄辈莽忆翻衅拨麦锭傀慕渝情捂回喘荚亮繁蚂奢HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧 0.77 911017 1185514LEU 0.77 1126683 1457340ILE 0.77 790013 1026839MET 0.78 1226042 1565440VAL 0.78 138426 177078CYS 0.77 1203529 1558560ALA 0.79 1924900 2440772GLY 0.86 436522 505373PRO 0.77 1017768 1315462GLU 0.77 1204273 1570743SER 0.77 1143925 1478447THR 0.78 1165757 1500427ASP40ºC20ºC面积比A40/A20峰面积面积比A40/A20峰面积40ºC20ºC 0.76 839183 1105530ARG 0.69 336837 487433LYS 0.79 1431665 1819675HIS 0.76 995832 1315479PHE 0.74 850976 1156850TYR仪器: Shimadzu氨基酸分析系统

(用OPA作柱后衍生)检测: RF-10AXLSuper

(Ex350nm,Em450nm)

(池温度

;20ºC,40ºC)

检测

池温度对荧光检测器的影响

(2)尽吾第叮恋浇祝才鹊桃主砷出吼顷新喘宦歉敝筋劝砍舆某呸份忌峻欠窘凛HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

BisphenolA在各种溶剂中的荧光光谱

(激发波长

270nm,使用背景校正)

检测

溶剂对荧光灵敏度的影响甲醇乙腈波长邯潭而迄仰卡托徒蠕极邻班逞痊她蓉掘搽奥蕊读未偷续若晴糜篙播弟妓吼HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧不冷却时,抗坏血酸逐渐降解.柱 :SCR-101N(250mmL.x7.9mmI.D.)流动相 :10mM草酸钠缓冲液(pH3.8),含有

1mMEDTA•2Na

流速 :1mL/min温度 :40ºC检测 :UV-VIS(245nm)抗坏血酸峰面积的变化

样品

冷却可以防止样品降解冷却未冷却例佛毋忻翻翻嘉眶柏狡拱锻佯柏熟福葵纹哎造堪娄帘大肉歌郑扛唁磅痰棠HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

样品

样品溶剂对峰形的影响

(1)流路方向

甲醇溶剂被分析物流路方向

水溶剂被分析物*水/甲醇作流动相的反相色谱不同样品溶剂对理论塔板数的影响.水溶剂甲醇/H2O甲醇溶剂样品:10ul咖啡因柱:Shim-packCLC-ODS(150mmL.x6mmI.D.)流动相:甲醇

/H2O=3/7流速:1mL/min温度

:室温.检测:270nm理论塔板数进样体积园吐听狱嗽皑拴稗同作鞘裁蒲苹雹嘲陋岛凌钝卸橙翱奇寺蹲规衔茨洗蕾者HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧左图.:样品溶剂水

/乙腈

=3/1(v/v)右图.:样品溶剂

-乙腈Column :STRODS-II

(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobile :20mMcitricacid(sodium)bufferPhase:solution(pH4.5)

/acetonitile=3/1(v/v)Flowrate :1mL/minTemp. :40ºCDetection :UV-VIS(240nm)

样品

样品溶剂对峰形的影响

(2)如果样品溶剂比流动相强

,峰形恶化.琉蓉甄更致堵据椒诸轻蜒斟嫁鼎助复蝗职帖销党润侨刺闭贺肮续泽患前阿HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧提高分析的准确度离线前处理很难保证完全一致,可能降低准确度简化操作离线处理需要很强的技能提高处理效率晚上也能进行自动前处理,可以极大的提高处理效率

样品

自动样品前处理的优点

盏柞渣胯割俯抚褂忍邀摈陷滤鹤蜕赂灰衬达疆冶揩沽观酸羚猫玻谅锰添标HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧

样品

HPLC柱切换系统

血样直接进样

(Co-SenseforBA)

泵分析柱自动进样反相内表面预处理柱Shim-PackMAYI-ODS泵检测器流动相流动相●●稀释流路多聚体，例如蛋白

药物膜药物和内表面示意图钧相嘴篱淬丑倪阔杠婴奏蔚楼臻襟捆第魏浦深贿申撞拈漳憨轧陷缸根攒栏HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧08.517Time(min)蛋白异丙基肾上腺素进样体积 :100μL流动相(进样路):0.1%磷酸/乙腈=95/5(v/v)检测 :异丙基肾上腺素；275nm

血浆基质；280nm

样品

用

Co-Sense对生物样品分析进行自动样品前处理

添加了异丙基肾上腺素的血浆分析唬亡援戚哀慰滁腹疟腰瓤懂蝎颤结攒鼓名沦译汹筹固贫钧挎兴甥屹踌池痪HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧血浆中分别添加

2mg/mLketoprofen和naproxen的回收率比较(50mL进样.)手动预处理(添加乙腈)用Co-Sense进行自动预处理

样品

不同预处理方法的回收率比较讫胸券剐蔷盎借特弥酣羌妹唾邵恰因添糟拒容青笔石涅篇潦涉秃盟尧内载HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧原因:由于离子作用力或

配位异构力引起的对

金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)清除吸附的化合物

（洗针)控制吸附产生

（使针惰性化)原因:由于树脂氢键力引起的吸附(脂溶性化合物)使用有机溶剂清洗转子密封槽改变转子密封材料来降低吸附

样品

过载的原因及控制使用自动进样器时交叉污染的原因及控制手段儿铲什琵避呸驭遏陪鼻腾罚钎诡诵军焚誊颈橡肮颇瘫榜团悟地加韦拒这家HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧清洗此表面是重要的针清洗状态进样状态样品环泵柱洗针口针针密封

样品

洗针机理

(全量进样)鹤陆窖琶詹渴岔既芭辰涡奄徊咏携钥郑喘啼拇雅争敷螟往仍取乡婉隘啥砰HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧若控制由于离子作用力或

配位异构力引起的对

金属离子的吸附(离子或者碱性化合物)…

酸化.大浓度的配位离子作离子对试剂.(例如)100mM高氯酸水溶液/甲醇(或乙腈)由于疏水作用力引起的化合物吸附(树脂型化合物)有机溶剂清洗.*(例如)100%甲醇,乙腈,THF等.

样品

洗针溶剂的选择骇茫吮探音旅契狼贴囚泼帖好筐搪期寻虱刻乖菇算徘佛沦骡蔬个窖卫像切HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧被分析物

:氯乙醇

(碱基化合物)进

2L的标准溶液

(含有

1.2mg/ml溶解化合物的流动相),连续注射

2L的流动相,比较面积.

柱 :Shim-packVP-ODS(150mmL.x2.0mmI.D.)流动相:含有100mMNaClO4的10mM磷酸缓冲液(pH2.6)/乙腈

=55/45(v/v)流速 :0.2mL/min温度:40ºC检测 :UV(260nm，usingsemimicrocell)

样品

降低由于碱性物质引起的交叉污染

(1)0.04250.0004251W/OWash0.07300.0007301W/Wash空白标准溶液交叉污染[%]相对峰面积针密封

: SUS清洗液

: 流动相洗针程序

:在洗针口浸洗

3sec.吸样品液.在洗针口浸洗

3sec.进样.硷那负胺踏矢恕鲤氛揩泽植砧象缩文贪裤雨炔堑鬃包噶带抖挛仁永绿铆旗HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧不同惰性化SUS针密封方法的比较0.00230.0000231特富龙涂层0.04250.0004251SUS0.00090.0000091特殊的金属涂层0.00210.0000211PEEK涂层BlankStandardSolution交叉污染

[%]相对面积浸入洗液

3sec.其他条件同上页相同.

样品

降低由于碱性物质引起的交叉污染

(2)夯乓肉掌粘裴恿饵攀舞陀远弃颜集淌什藉菱颓足缓主乓断豫倦插揪诌移抽HPLC高效液相色谱技巧HPLC高效液相色谱技巧进

2µL流动相的色谱图

样品

降低由于碱性物质引起的交叉污染

(3)在分析氯乙醇时(碱基化合物),通过浸洗针和针表面特殊的金属涂层，交叉污染从0.07%降低到0.001%!!