CN119486755A Dlk1抗体及治疗癌症的方法 （加利福尼亚大学校董会）

2024.08.06PCT/US2022/0521352022.12.07WO2023/107560EN2023.06.15与DLK1和第二抗原结合的双特异性抗原结合蛋抗原结合蛋白的方法和治疗患有癌症的受试者2EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSYYYYGMEYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:45)或其仅有1_5个氨b.来源于包含以下氨基酸序列的轻链可变DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYRIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:46)或其仅有1_5个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSIYSVHWVRQPPGKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:47)或其仅有1_5个氨b.来源于包含以下氨基酸序列的轻链可变DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:48)或其仅有1_5个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGDGSTSYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKPDGPLGQGTLVTVSS(SEQIDNO:49)或其仅有1_5个氨基酸不b.来源于包含以下氨基酸序列的轻链可变DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:50)或其仅有1_5个氨基酸不酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体3酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；b.重链CDR2氨基酸序列：IWGGGST(SEQIDNO:8)或其仅氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；者具有至少或约70％序列同一性的变体序酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；e.轻链CDR2氨基酸序列：KVS(SEQIDNO:17)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具变体序列；4IDNO:23)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序列；其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序变体序列；IDNO:31)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序列；其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序变体序列；5IDNO:39)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序列；其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变体序变体序列；EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSYYYYGMEYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:45)或其仅有1_5个氨DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYRIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:46)或其仅有1_5个氨基酸不同或QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSIYSVHWVRQPPGKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:47)或其仅有1_5个氨DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:48)或其仅有1_5个氨基酸6QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGDGSTSYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKPDGPLGQGTLVTVSS(SEQIDNO:49)或其仅有1_5个氨基酸不DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:50)或其仅有1_5个氨基酸不14.一种特异性结合人δ样非典型Notch配体GKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGb.抗体轻链，包含以下氨基酸序列：DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECa.所述抗原结合蛋白与具有根据SEQIDNO:19的氨基酸序列的人DLK1蛋白同工型_1b.所述抗原结合蛋白与具有根据SEQIDNO:69的氨基酸序列的人DLK1蛋白同工型_2d.所述抗原结合蛋白不结合具有根据SEQIDNO:20的氨基酸序列的小鼠DLK1蛋白(UniProtKBID:Q09163)，或所述抗原结合蛋白结合所述小鼠DLK1蛋白的亲和力是结合所16.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合人DLK1同工型1(UniProtID:P80370_1)和同工型2(Un17.如权利要求16所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以如下KD结合人DLK17a.所述人DLK1同工型1蛋白(UniProtID:P80370_1)的EGF样2结构域和EGF样3结构域19.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合所述20.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白是抗体或结合26.如权利要求20所述的抗原结合蛋白，其中所述结合抗原的抗体片段选自由以下组27.如权利要求20所述的抗原结合蛋白，其中所述结合抗原的抗体片段是单链可变片a.前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白中的任一者的可变轻链(VL)和可变重b.SEQIDNO:45和SEQIDNO:46中所示的氨c.SEQIDNO:47和SEQIDNO:429.如权利要求27所述的抗原结合蛋白，其中所述scFv包含SEQIDNO:58中所示的氨30.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是双特异31.如权利要求30所述的抗原结合蛋白，其中所述双特异性抗原结合蛋白或所述BiTE32.如权利要求30或31所述的抗原结合蛋白，其中所述双特异性抗原结合蛋白或所述839.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白抑制注射有人41.一种缀合物，所述缀合物包含前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白或本文43.如权利要求42所述的缀合物，其中所述化学治疗剂是通过阻断微管蛋白聚合来抑46.如权利要求42_45中任一项所述的缀合物，其中所述剂51.如权利要求50所述的缀合物，其中所述抗体是IgG抗体，任选地其中所述IgG是52.如权利要求41_52中任一项所述的缀合55.如权利要求42_54中任一项所述的缀合57.如权利要求41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与VC_PAB_MMAE缀958.如权利要求41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与VC_PAB_MMAE缀59.如权利要求41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与VC_PAB_MMAE缀60.如权利要求41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含与VC_PAB_MMAE缀求41_60中任一项所述的缀合物或权利要求61所述的融合蛋白的核70.如权利要求69所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细71.一种产生与δ样非典型Notch配体1(DLK1)蛋白结合的抗原72.一种产生融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含与δ样非典73.一种产生药物组合物的方法，所述方法包括将以下74.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1_40中任一项所述的抗原结合蛋75.一种治疗患有表达DLK1的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用76.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求7477.一种减小受试者的肿瘤大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求7478.一种预防受试者的癌症复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求7479.一种治疗被诊断为DLK1低过表达者的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述81.如权利要求75_79中任一项所述的方法，其中所述施用诱导表达δ82.一种检测样品中的δ样非典型Notch配体1(DLK1)的方法，所述与权利要求1_40中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求41_60中任一项所述的缀合物或83.一种诊断受试者的δ样非典型Notch配体1(DLK1)阳性癌症包含从所述受试者获得的细胞或组织的生物样品与权利要求1_40中任一项所述的抗原结84.如权利要求83所述的方法，所述方法还包括通过向被诊断为患有DLK1阳性癌症的受试者施用权利要求1_40中任一项所述的抗原结合蛋白、权利要求41_60中任一项所述的85.一种活化T细胞以使其靶向受试者的表达DLK1述受试者施用权利要求30_38中任一项所述的双86.一种诱导受试者中针对表达DLK1的癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性88.一种药盒，所述药盒包括(a)权利要求1_4求41_60中任一项所述的缀合物、权利要求61所述的融合蛋白、权利要求62或63所述的核[0002]本申请要求2021年12月7日提交的美国临时申请第63/286,896号的权益，所述申[0003]本公开大体上涉及对δ样非经典Notch配体1(DeltaLikeNon_CanonicalNotch本公开的抗原结合蛋白在没有任何其它部分连接至所述抗原结合蛋白的情况下抑制受试本文提供的抗原结合蛋白的抑制作用允许此类实体可用于减少肿瘤生长和治疗患有肿瘤原结合蛋白。在各个方面，所述抗原结合蛋白包原结合蛋白可以包含此处描述的抗原结合蛋白中的任一种。第二抗原可以是细胞表面蛋可以具有与本文所述的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白缀合的不同数量的异源部括向所述受试者施用有效治疗所述受试者的癌症的量的本公开的药种抑制受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合[0018]图1显示了一组抗DLK1嵌合mAb在DLK1+HEPG2人肝细胞癌细胞系异种移植物中的557(也称为04_557m)和DLK1_559(也称为04_559m))进行4次重复剂量的治疗后肿瘤体积体是通过将人IgG1的轻链和重链可变区替换为小鼠单克隆抗DLK1抗体的轻链和重链可变[0019]图2显示了一组人源化DLK1mAb在DLK1+CORL279人小细胞肺癌(SCLC)细胞系异种移植物中的功效。图2表示带有DLK1阳性小细胞肺癌细胞(COR_L279)的小鼠在每周用10mg/kg非靶向IgG抗体对照或9种不同的抗DLK1人源化抗体(DLK1_547_h2、DLK1_548_h4、体重变化百分比(C)的图。[0020]图3显示了在用DLK1_ADC治疗后DLK1阳性(A_C)人肿瘤异种移植物相对于DLK1阴性(D_F)人肿瘤异种移植物的选择性肿瘤[0021]图4显示了人源化DLK1_ADC在DLK1阳性CORL279人SCLC细胞系异种移植物中的功效。图4显示了带有人DLK1阳性人小细胞肺癌细胞系COR_L279的小鼠在每周用5mg/kg对照IgG抗体或人源化抗DLK1抗体与MMAE缀合的抗体药物缀合物(ADC)(DLK1_ADC_547_h2、DLK1_ADC_562_h10和DLK1_ADC_561_f1)进行3次重复剂量的治疗后肿瘤体积(mm3)随时间的变化(A)和第13天时肿瘤体积的平均变化(mm3)(B)以及体重变化百分比(C)的图。IgG是[0022]图5显示，人源化DLK1_ADC在DLK1阴性M202人黑色素瘤细胞系异种移植物中不具有抗肿瘤活性。图5显示了带有人DLK1阴性人黑色素瘤细胞系M202的小鼠在每周用5mg/kgDLK1_ADC_562_h10和DLK1_ADC_561_f1)进行3次重复剂量的治疗后肿瘤体积(mm3)随时间[0023]图6汇总了三种主要的人源化抗DLK1抗体的生物化学、生物物理和细胞生物学特[0024]图7显示了三种人源化抗DLK1抗体_MMAE缀合物和一种人源化抗DLK1抗体在人DLK1阳性小细胞肺癌细胞系(COR_L279[0025]图8汇总了通过尺寸排阻色谱法和非还原SDS_PAGE分析的在不同温度下长期储存对人源化抗DLK1抗体(04_0561_F1和04_0562_h10)的聚集状态和稳定性的影响。下面一组ml浓度下，长期储存(5周)和温度应激(室温或37℃)不会引起明显抗体聚集和降解(通过低降解水平。[0026]图9显示了不同温度和长期储存对DLK1hAb04_0547_h2(10mg/ml)稳定性的影响，其中通过非还原SDSPAGE评估抗体完整性并通过SEC评估抗体聚集情况(_80℃对比4号A0A2K5TMQ6)、小鼠DLK1(UniProtKB登录号Q09163)和大鼠DLK1(UniProtKB登录号列出了与人DLK1氨基酸序列的同一性百分比以及DLK1蛋白的UniProtKB和[0028]图11显示了有关呈与mGFP荧光蛋白的融合蛋白形式的三种人源化抗DLK1抗体[0029]图12显示了在培养的COR_L279DLK1阳性人小细胞肺癌细胞中抗DLK1抗体内化的[0030]图13显示了抗DLK1抗体在培养的HEPG2肝癌细胞中的细胞内化情况。阴性对照–[0031]图14显示了在培养的COR_L279DLK1阳性人小细胞肺癌细胞中人源化抗DLK1抗体[0032]图15显示了在培养的COR_L279DLK1阳性人小细胞肺癌细胞中人源化抗DLK1抗体[0034]图17显示了在培养的COR_L279DLK1阳性人小细胞肺癌细胞中进行的抗DLK1抗体[0035]图18显示了在培养的COR_L279DLK1阳性人小细胞肺癌细胞中人源化抗DLK1抗体与MMAE的3种抗体药物缀合物和1种非ADC缀合的人源化抗DLK1抗体的细胞内化的时间过[0036]图19显示了人源化抗DLK1抗体04_0547_h2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0037]图20显示了人源化抗DLK1抗体04_0561_F1的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0039]图22显示了人源化抗DLK1抗体04_0548_h4的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0040]图23显示了人源化抗DLK1抗体04_0557_F2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0041]图24显示了人源化抗DLK1抗体04_0557_h3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0042]图25显示了人源化抗DLK1抗体04_0559_F2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0043]图26显示了人源化抗DLK1抗体04_0559_h4的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0044]图27显示了人源化抗DLK1抗体04_0565_F2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)[0045]图28显示了三种人源化抗DLK1抗体04_0547_h2、04_0561_F1和04_0562_h10的重于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约(BudapestTreatyontheInternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismsforthePurposesofPatent[0046]图29显示了五种人源化抗DLK1抗体04_0548_h4、04_0557_F2、04_0559_F2、04_方法定义的互补决定区(CDR)和框架区(FR)的氨基酸序列和产生该抗体的表达载体的名[0047]图30显示了在本发明的人源化抗DLK1抗体的一些实施方案中人免疫球蛋白轻链ĸ[0049]图32显示了编码人免疫球蛋白轻链ĸ恒定区(IGHKC)和人免疫球蛋白重链恒定区Fluor647(AF647)染料标记，与对照HEK293T细胞或工程改式的长型人DLK1蛋白的融合物(HEK293TDLK1mGFPG06(长型))或人_鼠嵌合DLK1蛋白的HEK293T细胞结合，在该人_鼠嵌合DLK1蛋白中，含有一个或多个来自DLK1HM1_mGFP)、区域2(835HEK293TDLK1HM2_mGFP)、区域3(836HEK293TDLK1HM3_(851HEK293TDLK1HM6_mGFP)、区域7(848HEK293TDLK1HM7_mGFP)或区域8(849HEK293TDLK1HM8_mGFP)的EGF样结构域的蛋白质区段被来自小鼠DLK1蛋白的相应区域替代。DLK1_561_F1抗体与人DLK1蛋白的区域6和区域7(HM6和HM7)结合，对应于氨基酸残基55_大鼠和食蟹猕猴DLK1蛋白的氨基酸序列与人DLK[0053]图36显示了长型人DLK1蛋白的预测结构(UniProtKB：P80370)以及长型和短型人DLK1蛋白的拓扑结构中的04_561_F1抗体结合位点。图36显示了(A)长型人DLK1蛋白型人DLK1蛋白(DLK_FL)的氨基酸编号24和169以及信号肽及跨膜结构域和随后的细胞质结据图34的表位定位实验结果，DLK1_561_F1抗体与EGF样结构域2和EGF样结构域3内对应于氨基酸编号55_113的表位结合。(B)DLK1的两种已知人同工型的图：全长可裂解同工型1(DLK1_FL)和膜结合同工型2(DLK1_MB)。大箭头标识出ADAM17介导的全长配体的近膜裂解(hIgG1)对照抗体与亲本HEK293T细胞(HEK293Tparental)、表达长型人DLK1_mGFP融合蛋白的HEK293细胞(HEK293TDLK1mGFPG06(长型))或表达短型人DLK1_mGFP融合蛋白的HEK293T细胞(HEK293TDLK1Iso2_mGFPmasspop(短型))的结合活性的流式细胞术评估。关与缀合AF_647荧光团的抗DLK1抗体结合的细胞的(间接)流式细胞分析，该抗体是用抗了DLK1_561_F1在(A)DLK1+CORL279和DLK1_M202细胞中以及(B)工程改造成过表达短型DLK1(DLK_MB)的HEK293细胞中的ADCC效力。通过确定上清液评估NFAT活化情况，NFAT活化表明诱导了ADCC反应。数据显示，DLK1_561_F1抗体在表达天然DLK1的CORL279细胞和过表达短型DLK1的HEK293细胞中诱导ADC理的细胞和仅用AF647抗His标签二抗处理的细胞的AF647荧光充[0058]图41显示了使用带有NFAT_RE报告基因的Jurkat细胞评估抗DLK1_CD3双特异性抗体(BiTE)的T细胞活化情况。将DLK1+细胞系(JR和CO0561_F1Bs双特异性抗体和Promega的T细胞活化生物测定药盒(NFAT_REJ1621)中的JurkatT细胞共孵育将引起显著T细胞活化，但用DLK1_细胞系(Raji)时不会引起T细胞活每条轻链和重链的N末端区域构成，而恒定区由重链和轻链各自的C末端部分构成。(Janeway等人,“StructureoftheAntibodyMoleculeandtheImmunoglobulinGenes”,Immunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease,第4版,ElsevierSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,PublicHealthServiceN.I.H.,或轻链CDR(Kabat等人,1991；还参见Chothia和Lesk,1987,同上；Chothia等人,1989,轻链CDR残基。框架区内的氨基酸可以被例如在人框架或人共有框架中鉴定的任何适合的源化可以涉及将小鼠抗体等非人抗体的CDR移植到人抗体中。人源化还可以涉及选择氨基括以下序列。开的各个方面，本公开的抗原结合蛋白是抗体的抗原段、抗原结合片段、抗原结合部分)。在各种情况下，结合抗原的抗体片段是Fab片段或F2片段。构建块是单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，它包含通过约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH和VL结构域)。肽体(peptibody)或肽_Fc融合物是另一[0084]所有N聚糖都具有共同的核心糖序列：Manα1–6(Manα1–3)Manβ1–4GlcNAcβ1–4GlcNAcβ1AsnXSer/Thr(Man3GlcNAc2Asn)，并分类为以下三种类型之一：[0085]N连接聚糖通常包含一种或多种单糖，如半乳糖(Gal)、N乙酰半乳糖胺露糖(Man)、N乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N0乙酰神经氨酸基和三个Man残基组成的核心聚糖结构的连接。内质网中形成的聚糖复合物在高尔基体中 1334(2015)。白中至少或约25％是包括含无岩藻糖基化聚糖的Fc多肽的抗原结合蛋白。在示例性方面，FX的基因。参见例如国际专利公开号WO2017/079165A1；Kanda等人,JBiotechnol130,Brinkmann,DrugDiscoveryToday20(7):838_847(2015)；Zhang等人,ExpHematol[0094]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是由抗体的一些或全部恒定结构域构旋钮和保持技术(knobandholdtechnology)形成的双特异性单克隆抗体。在示例性方种不同抗原具有四价性的融合蛋白，例如IgGC末端scFv融合物和IgGN末端scFv融合物。具有特异性的IgG的LC和HC可变区通过接头与对第二种抗原具有特异性的IgG的N末端LC和该融合物涉及用双特异性双抗体替换IgG的Fa链双抗体、串联双抗体(TandAb)、双亲和重定向分子(dual_affinityretargetingmolecule，DART)、dock_a130)。在各个方面，双特异性抗原结合蛋白是双特异性F(mab1)2、scFv、双特异性双抗体是使用crossMab技术产生的蛋白质，所述蛋白质在PNAS108(27):11187_92(2011)中有描[0097]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是双特异性T细胞衔接物或BiTE②。BiTEHC可变区以及对第二抗原具有特异性的第二抗体的LC和HC可变区。在一些实施方案中，含当前所公开的DLK1抗体的LC或HC可变区中的至少一者(如果不是两者)以及对第二抗原对第二抗原具有特异性的第二抗体的LC和H加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理酸可从诸如MacromolecularResources(FortCollins,CO)和Synthegen(Houston,TX)等毒。载体可以是基于质粒的表达载体。在各个方面，载体选自由以下组成的组：pUC系列(FermentasLifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJoIIa,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,PaloAlto,CA)。还可使用噬菌体载体，例如λGTIO、λGTl1、λZapIIpBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK_Cl、pMAM和pMAMneo[0110]本公开的载体可使用例如Sambrook等人(同上文)和Ausubel等人(同上文)中所描原营养等等。目前所公开的表达载体的适合标记物基因包括例如新霉素(neomycin)/G418其功能部分和功能变体)的核苷酸序列，或连接到与编码该多肽的核苷酸序列互补或杂交[0116]在各个方面，抗原结合蛋白是糖基化蛋白并且宿主细胞是有糖基化能力的细胞。程改造成缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如DUKX_X11、DG44)、人胚肾293细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人,2007；Khan,AdvPharmBull3(2):257_的，并且在本领域中有描述。参见例如Arora,“CellCultureMedia:AReview”MATER[0122]制备抗原结合蛋白的方法可以包括从细胞培养物或其上清液中纯化所述蛋白质白质的配制物的步骤。这些步骤在以下文献中有描述：FormulationandProcessDevelopmentStrategiesforManufacturing,Jameel和Hershenson编辑,JohnWiley&[0124]在各个方面，连接至多肽和抗原结合蛋白的抗原结合蛋白是融合蛋白的一部白(PE)或吲哚菁绿(indocyanine，Cy5))等可将小于所述分子量)。在一些方面，聚合物的平均分子量在约5kDa与约50kDa之间、在约sympathomemetics)、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、利尿剂、心肌收缩力增强剂碱(cinchonaalkaloids)、叶酸拮抗剂、喹啉衍生物、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis抑制剂、烷基磺酸酯类、乙烯亚胺类、咪唑并四嗪类、氮芥类似物(nitrogenmustard多卡因(lidocaine)、盐酸阿替卡因(articainehydrochloride)、盐酸布比卡因(bupivacainehydrochloride))、解热药(antipyretics)、安眠药(hynotics)和镇静药物(opioids)、对氨基苯酚衍生物、醇脱氢酶抑制剂、肝素拮抗剂[0135]本公开的抗原结合蛋白可以与一种或多种有效抑制肿瘤转移的细胞因子和生长因子缀合，并且其中所述细胞因子或生长因子已被证实对至少一种细胞群具有抗增殖作颁发的美国专利号4,473,692和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布号EP0074256；1985年10月8日颁发的美国专利号4,545,880和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布号EP0074256；1983年9月14日公布的欧洲专利申请公布号EP0088642；Wani等人,J.Med.Chem.,29,2358一2363(1986)；Nitta等人,Proc.14thInternational系列号581,916和1991年3月20日公布的欧洲专利申请公布号EP418099；1985年4月23日颁发的美国专利号4,513,138和1983年3月23日公布的欧洲专利申请公布号EP0074770；1983年8月16日颁发的美国专利号4,399,276和1982年7月28日公布的欧洲专利申请公布号类化合物均可在市面上购得和/或可以用常规技术(包括上面列出的参考文献中所描述的[0150]1991年4月2日颁发的美国专利号5,004,758和1989年6月21日以公开号EP0321122公开的欧洲专利申请号88311366.4中详细描述了喜树碱类似物类的多种化合物(包括其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物)的制备以及包含此类喜树碱类似物类化合物和但不限于阿霉素(doxorubicin)、丝裂霉素、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素学治疗剂。许多半合成衍生物已在化学和药理学方面进行研究(参见O.VanTellingen等于长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉醇(Taxol)和长春瑞滨(vinorelbine)。后两种抗有丝分裂生物碱可分别从EliLillyandCompany和PierreFabreLaboratories购得(参见美国专利号力学来抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂，例如美登木素生物碱(maytansinoid)或其衍生物缀合物包含连接至连接基团的本公开的抗体，该连接基团连接至组织蛋白酶可裂解接头，放出优先渗透到肿瘤细胞内的药物。在其它实施方个丝氨酸或苏氨酸残基的羟基键接)。接头所结合的位点可以是抗体部分的氨基酸序列中可以与细胞毒性化合物反应。连接部分可含有允许细胞毒性部分在特定部位释放的化学的其它接头包括不可裂解接头(例如US2005016993裂解剂裂解。接头可以是例如被细胞内或细胞外肽[0178]在一些实施方案中，肽接头是马来酰亚胺基己酰甘氨酸_甘氨酸_苯丙氨酸_甘氨如美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,羟基琥珀酰亚胺基团(NHS基团)和羰基反应性肼基的异双官能交联剂也可用于连接细胞毒由还原二硫键(例如来自抗体或抗原结合蛋白的链间或链内二硫键)得到的半胱氨酸或经过工程改造的未配对半胱氨酸)被用作缀合位点。本文描述的所有以上列出的接头和异源部分均可从市场上购得和/或可以通过常规技术(包括以上列出的参考文献中描述的技术)[0186]异源部分与抗原结合蛋白的比率(HAR)表示每个抗原结合分子上连接的异源部分与不同数量的异源部分缀合。在一些实施方案中，异质缀合物遵循缀合物的高斯分布[0189]在一些实施方案中，异源部分以位点特异性方式与抗原结合蛋白(例如抗体)缀缀合(Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26:925_932；Dimasi等人(2017)Mol.Pharm.14:1501_1516；Shen等人(2012)Nat.Biotechnol.30:184_9)；硫醇桥接头(Behrens等人(2015)Mol.Pharm.12:3986_98)；使用转谷氨酰胺酶在谷氨酰胺处缀合(Dennler等人(2013)MethodsMol.Bio.1045:205_15；Dennler等人(2014)BioconjugChem.25:569_78)；在经过工程改造的非天然氨基酸残基处缀合(Axup等人(2012)Proc1766_71；VanBrunt等人(2015)BioconjugChem26:2249_60；Zimmerman等人(2014)BioconjugChem25:351_61)；硒代半胱氨酸缀合(Li等人(2017)CellChemBiol24:433_类似物处缀合(Ramakrishnan和Qasba(2002)JBiolChem277:20833_9；vanGeel等人(2015)BioconjugChem26:2233_42)；经由聚糖工程改造(Zhou等人(2014)Bioconjug改造的谷氨酰胺标签或分选酶A介导的转肽作用(Strop等人(2013)ChemBiol20:161_7；Beerli等人(2015)PLoSOne10:e0131177)；以及经由醛标签(Wu等人(2009)ProcNatl[0191]仅基于抗体概况或药物有效负载概况，不可能提前预测哪种抗体_药物缀合物对性的原因尚不十分清楚，使得无法在设计新的抗体_药物缀合物时进行准确的预测。据推体药物缀合物具有更好的细胞摄取能力，从而使得在细胞内释放更高水平的细胞毒性有道如何预测抗体药物缀合物的最高效或最有效的亲水部分。亲水性代谢物一般具有较低的膜渗透性，并述组合物包含单一类型(例如结构)的本公开的抗原结合蛋白或包含两种或更多种本公开选地与本公开的抗原结合蛋白混合或与抗原结合蛋白缀合的本文所公开的作为异源部分[0198]在一些实施方案中，活性剂以适合向患者施用的纯度水平存在于药物组合物HandbookofPharmaceuticalExcipients,第三版,A.H.Kibbe(PharmaceuticalPress,London,UK,2000)，其全文以引用的方式并入本文。Remington’sPharmaceutical[0201]在各个方面，药物组合物包含在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒的配制材[0210]在一些实施方案中，胃肠外配制物含配制物中的表面活性剂的量以重量计通常在约5％至约15％的范围内。适合的表面活性剂普通技术人员众所周知的(参见例如PharmaceuticsandPharmacyPractice,J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers编辑,第238_250页(1982)；以及ASHPHandbookonInjectableDrugs,Toissel,第4版,第622_630页[0215]本公开的活性剂的剂量还将由施用本公开的特定活性剂可能伴随的任何不良副活性剂的剂量可以是每天每千克所治疗受试者的体重约0.0001g至约1g、每天每千克体重活性剂释放到其所施用的身体内的方式根据在料(例如聚合物)的植入式组合物，其中活性剂被所[0218]在某些方面，包含活性剂的药物组合物被修饰成具有任何类型的体内释放特[0222]因此，本文提供了抑制受试者的肿瘤生长的方法和减小受试者的肿瘤大小的方的方法所提供的治疗可以包括所治疗癌症的一种或多种疾患或症状或体征的治疗。此外，[0227]本公开的抗原结合蛋白还可用于检测样品中的DLK1或诊断DLK1阳性癌症。因此，[0229]在本公开的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，包括但不限于啮齿目(orderArtiodactyla)哺乳动物，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目(order一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；(b)表1和/或图19[0238]在各个实施方案中，第二抗原是有助于T细胞活化的共刺激分子，例如CD40或4_列的抗原结合蛋白，或其仅1_5个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序元数量在1至8的范围内，优选地其中每一抗原结合蛋白缀合的剂的平均单元数量在3_8的公开另外提供了包含本公开的核酸或载体的[0245]本公开提供一种产生与DLK1蛋白结合的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白[0248]本公开提供了一种检测样品中的DLK1(CLD18.[0253]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRSYYYYGMEYWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:45)或其仅有1_5[0255]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYRIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:46)或其仅有1_5个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列。[0258]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSIYSVHWVRQPPGKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:47)或其仅有1_5[0260]DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:48)或其仅有1_5个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列。[0263]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGDGSTSYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKPDGPLGQGTLVTVSS(SEQIDNO:49)或其仅有1_5个氨基[0265]DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列。氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；两个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；两个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性或两个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性的变体序列；两个氨基酸不同或者具有至少或约70％序列同一性者具有至少或约70％序列同一性的变体序性的变体序列；25)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变[0298]g.轻链FR3，包含以下氨基酸序列：YRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC33)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变[0308]g.轻链FR3，包含以下氨基酸序列：TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYC41)或其仅有一个或两个氨基酸不同或者具有至少或约85％、90％或95％序列同一性的变[0318]g.轻链FR3，包含以下氨基酸序列：NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC[0323]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGTNTYYADSVKGR或[0325]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASHDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYRIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:46)或其仅有1_5个氨基酸不[0328]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSIYSVHWVRQPPGKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:47)或其仅有1_5或[0330]DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLQSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:48)或其仅有1_5个氨[0333]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKGLEWIGVIWGDGSTSYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKPDGPLGQGTLVTVSS(SEQIDNO:49)或其仅有1_5个氨基[0335]DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQTTHVPWTFGQGTKLEIK(SEQIDNO:50)或其仅有1_5个氨基RQPPGKGLEWIGLIWGGGSTDYNPSLKSRVTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARKEGNYLWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRYLAWYQQKPGQPPKLLVYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQHYSIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[0340]a.所述抗原结合蛋白与具有根据SEQIDNO:19的氨基酸序列的人DLK1蛋白同工型_1(UniProtKBID:P80370[0341]b.所述抗原结合蛋白与具有根据SEQIDNO:69的氨基酸序列的人DLK1蛋白同工型_2(UniProtKBID:P80370[0342]c.所述抗原结合蛋白结合人DLK1的细胞外结构域，其解离常数([0343]d.所述抗原结合蛋白不结合具有根据SEQIDNO:20的氨基酸序列的小鼠DLK1蛋白(UniProtKBID:Q09163)，或所述抗原结合蛋白[0345]16.如前述实施方案中任一项所述人DLK1同工型1(UniProtID:P80370_1)和同工型2(Uni[0346]17.如16所述的抗原结合蛋白，其中所述抗型1(UniProtID:P80370_1)和同工型2(UniP[0352]a.人DLK1同工型1蛋白(UniProtID:P80370_1)的EGF样2结构域和EGF样3结构域[0354]19.如前述实施方案中任一项所述的所述人DLK1蛋白并在DLK1阳性细胞中诱导(a)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)反[0355]20.如前述实施方案中任一项所述的抗[0361]26.如20所述的抗原结合蛋白，2[0362]27.如20所述的抗原结合蛋白，其中所述结合抗原的抗体片段是单链可变片段[0364]a.前述实施方案中任一项所述的抗原结合蛋白中的任一者的可变轻链(VL)和可[0370]30.如前述实施方案中任一项所述[0371]31.如30所述的抗原结合蛋白，其中[0375]32.如30或31所述的抗原结合蛋白，其中所[0382]39.如前述实施方案中任一项所述的抗[0383]40.如前述实施方案中任一项所述的抗[0384]41.一种缀合物，所述缀合物包含[0385]42.如41所述的缀合物，所述缀[0386]43.如42所述的缀合物，其中所述化学[0394]51.如50所述的缀合物，其中所述抗体是IgG抗体，任选地其中所述IgG是IgG1、[0400]57.如41_56中任一项所述的缀合物，其中所[0401]58.如41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀合[0402]59.如41_56中任一项所述的缀合物，其中所述缀[0403]60.如41_56中任一项所述的缀合物，其中所述[0404]61.一种融合蛋白，所述融合[0418]75.一种治疗患有表达DLK1的癌症[0419]76.一种抑制受试者的肿瘤生长的方法[0420]77.一种减小受试者的肿瘤大小的方[0421]78.一种预防受试者的癌症复发的方法，[0422]79.一种治疗被诊断为DLK1低过表达者所述受试者施用如74所述的药物组合物以预防[0424]81.如75_79中任一项所述的方法，其中所述施用诱导样品与如1_40中任一项所述的抗原结合蛋白、如41_60中任一项所述的缀合物或如61所述括使包含从所述受试者获得的细胞或组织的生物样品与如1_40中任一项所述的抗原结合[0427]84.如83所述的方法，所述方法还包括者施用如1_40中任一项所述的抗原结合蛋白、如41_60中任一项所述的缀合物或如61所述[0429]86.一种诱导受试者中针对表达DLK1的癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性P80370_1和以下氨基酸序列：MTATEALLRVLLLLLAFGHSTYGAECFPACNPQNGFCEDDNVCRCQPGWQGPLCDQCVTSPGCLHGLCGEPGQCICTDGWDGELCDRDVRACSSAPCANNRTCVSLDDGLYECSCAPGYSGKDCQKKDGPCVINGSPCQHGGTCVDDEGRASHASCLCPPGFSGNFCEIVANSCTPNPCENDGVCTDIGGDFRCRCPAGFIDKTCSRPVTNCASSPCQNGGTCLQHTQVSYECLCKPEFTGLTCVKKRALSPQQVTRLPSGYGLAYRLTPGVHELPVQQPEHRILKVSMKELNKKTPLLTEGQAICFTILGVLTSLVVLGTVGIVFLNKCETWVSNLRYNHMLRKKKNLLLQYNSGEDLAVNIIFPEKIDMTTFSKEAGDE流式细胞术评估抗体结合表达DLK1的肽和/或人癌细胞的能力。将潜在的阳性抗体重新排[0438]鉴定出对产生与人DLK1蛋白结合的抗体呈阳性的杂交瘤，并分离出编码针对人生呈人全长IgG抗体(例如IgG1)形式的DLK1抗体。将抗体的重链和轻链可变区克隆到抗体Scientific,USA)对所述载体进行工程改造。按照药盒(ExpiCHOTM表达系统，目录号：A29133，ThermoFisherScientific,USA)中提供的方案，将抗体表达载体转染到CHO细胞DLK1抗体直接与AlexaFluor@647NHS酯(琥珀酰亚胺酯，目录号A20106(ThermoFisher[0439]在FACS测定中使用表达DLK1的细胞以确定DLK1抗体与细胞表面上的DLK1结合的Alexa647的DLK1mAb一起在冰上于黑暗中孵育30分钟。将DLK1mAb直接用Alexa变(VL)序列与来自人VH基因和人VLĸ基因的已知人种系序列的文库(theinternationalImMunoGeneTicsinformationsystem8；创始人和董事:亲本鼠类序列以优化人源化抗体的结合。人源化抗体各型式的序列提供于表1和图19至图[0445]基本上按照实施例1所述的方式构建和表达人源化抗体DLK1_547_h2、DLK1_548_DLK1抗体04_0547_h2的表达质粒)。进行FACS测定以确定人源化抗体(1μg或0.2μg)与[0446]根据体外抗原结合数据，选出三种人源化抗体(04_547_h2(也称为DLK1_547_h2、562_h10、04_0562_h10))进行进一步测试和开发。这些抗体来源于小鼠单克隆抗体DLK1_1无胸腺裸小鼠(CharlesRiverLaboratories)中建立不同人癌细胞系的异种移植模型。557和DLK1_559)在带有DLK1阳性HepG2人肝细胞癌细胞异种移植物的小鼠中的肿瘤生长抑制特性。图1A显示了用非靶向IgG对照抗体或针对DLK1的小鼠单克隆抗体处理的HEPG2内每个治疗组的肿瘤体积的平均变化(±SEM[0450]图2显示了一组人源化DLK1mAb抑制DLK1阳性CORL279人小细胞肺癌(SCLC)细胞肿瘤体积±SEM。图2B是表示在21天的治疗内每个治疗组肿瘤体积的平均变化(+SEM)的条减小。图3D_F显示了如以上所描述用对照或DLK1_ADC处理的SNUC1、LS513和M202(全部为[0452]图4显示了人源化DLK1_ADC在抑制DLK1阳性CORL279人SCLC细胞系异种移植物生长和减小肿瘤体积方面的功效。图5A显示了用非靶向IgG对照抗体或由人源化DLK1_mAb产生的3种不同DLK1_ADC处理CORL279(DLK1+)细胞系异种移植物的结果。每周一次通过IV尾肿瘤体积±SEM。图4B是表示在13天的研究(对照臂的最后一天)内每个治疗组肿瘤体积的体治疗的动物的肿瘤生长显著，故在第13天处死动物，此时异种移植物的平均大小是约[0453]图5显示了人源化DLK1_ADC在DLK1阴性M202人黑色素瘤细胞系异种移植物中不具有抗肿瘤活性。图5A显示了用非靶向IgG对照抗体或由人源化DLK1_mAb产生的3种不同DLK1_ADC处理M202(DLK1_)细胞系异种移植物的结果。每周一次通过IV尾静脉注射5mg/kg对照抗体或ADC来治疗小鼠，共计3次重复剂量。每个臂8只小鼠。线代表平均肿瘤体积±[0454]本文提供的DKL1抗体药物缀合物(ADC)已通过可裂解接头VC_PAB与细胞毒剂MMAE人小细胞肺癌细胞的结合比与DLK1阴性M202人黑色素瘤细胞的结合强。抗体对HEK293T细胞或DLK1阳性COR_L279细胞表面上过表达的人DLK1的结合亲和力显示，04_0561_F1和04_0562_h10抗体的解离常数(KD)是约0.5nM至4nM，而04_0547_h2抗体的KD略高，约为5nM至04_0562_h10抗体的KD和EC50值低于04_0561_F1，观察到少于3.5％的降解[0457]图9显示了在10mg/mL下不同温度和7天储存对人源化抗DLK1抗体04_0547_h2的稳明能与HEK293T细胞上过表达的人和猴DLK1结合，但它们与啮齿动物DLK1蛋白结合的能力使用UniProtKB登录号Q09163获得并具有以下氨基酸序列：MIATGALLRVLLLLLAFGHSTYGAECDPPCDPQYGFCEADNVCRCHVGWEGPLCDKCVTAPGCVNGVCKEPWQCICKDGWDGKFCEIDVRACTSTPCANNGTCVDLEKGQYECSCTPGFSGKDCQHKAGPCVINGSPCQHGGACVDDEGQASHASCLCPPGFSGNFCEIVAATNSCTPNPCENDGVCTDIGGDFRCRCPAGFVDKTCSRPVSNCASGPCQNGGTCLQHTQVSFECLCKPPFMGPTCAKKRGASPVQVTHLPSGYGLTYRLTPGVHELPVQQPEQHILKVSMKELNKSTPLLTEGQAICFTILGVLTSLVVLGTVAIVFLNKCETWVSNLRYNHTFRKKKNLLLQYNSGEELAVNIIFPEKIDMTTFNKEAG供了人源化抗DLK1抗体04_0559_h4、04_559_F2(也称为04_0559_F2)、04_0561_F1、04_0562_h10和04_565_F2(也称为04_0565_F2)以及基准KO_DLK1_hIgG1抗体和非靶向hIgG1的主要抗体(04_0547_h2_MMAE_AF647、04_0561_F1_MMAE_AF647和04_0562_h10_MMAE_AF647)以及用AF_647标记但未与MMAE形成缀合物的主要抗体04_0561_F1(04_0561_F1_变区的框架(FR)和互补决定区(CDR)的氨基酸序列以及整个重链和轻链可变区(VH和VL)的JH,MacindoeG,HetheringtonJ,MartinAC.abYsis:IntegratedAntibodySequenceSVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL[0462]这一序列对应于UniProtID:P01834中给出的ĸ轻链恒定区序列，但UniProtID:以通过将UniProtID:P01834中提供的氨基酸序列附加到可变轻链区的C末端来获得完整NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG[0464]图31提供了编码人源化DLK1抗体轻链和重链可变区的DNA序列，而图32提供了编[0465]图33提供了人源化抗DLK1抗体(04_0561_F1)和小鼠单克隆抗DLK1抗体(04_0561_m)的重链和轻链可变区编码序列。[0466]有关三种主要抗DLK1抗体之一的交叉反应性数据的分析表明，04_0561_F1(也称家族所有成员都彼此相关，但人和小鼠DLK1蛋白共有约85％的氨基酸序列同一性(参见图DLK1抗体结合表位在长型人DLK1蛋白(长型或同工型1)中的位置(该表位在长型小鼠DLK1氨基酸序列取代为小鼠DLK1蛋白中的相应序列(有关长型人和小鼠DLK1蛋白之间的氨基酸型嵌合人DLK1蛋白的融合物的HEK293T细胞，其中区域1(834HEK293T561_F1_AF647与这两种HEK293T细胞834和835的结合大